Bakteriorhodopsyna (bR) jako medium przewodzenia elektronicznego: transport prądu przez monowarstwy zawierające bR

wyniki i dyskusja

przygotowano zawiesinę fragmentów PM zawierających bR typu dzikiego (12) i odtworzono z egzogenną fosfatydylocholiną jaja (PC) do pęcherzyków przez modyfikację metody Rackera (13). W celu dalszego sprawdzenia charakterystyki prądowo-napięciowej zależnej od ilości białka (I–V) przygotowano inną pęcherzykową zawiesinę bR, stosując oktylotioglukozyd (OTG) jako detergent (14). Monowarstwy rodzimych membran zawierających bR otrzymano następnie przez adsorpcję pęcherzyków na podłożu Al (≈50-nm gruba folia AL odparowana na kwarcu) z warstwą naturalnego tlenku glinu na jego powierzchni (przedstawianego tutaj jako AlOx). Dołączone pęcherzyki następnie otwierają się i łączą, tworząc dwuwarstwy lipidowe podtrzymywane na stałe. Aby promować adsorpcję elektrostatyczną pęcherzyków, najpierw silanizowaliśmy powierzchnię podłoża za pomocą (3-aminopropylo)trimetoksysilanu (APTMS) (15), a następnie poddaliśmy obróbce 0,1 m HCl, aby uzyskać dodatnio naładowaną powierzchnię. Zarówno zawiesiny pęcherzyków bR/PC, jak i bR/OTG wykazały indukowane światłem wewnętrzne pompowanie protonów, jak stwierdzono wcześniej (13, 16). Opierając się na tej obserwacji, postulujemy preferencyjną orientację bR ze stroną cytoplazmatyczną skierowaną do powierzchni podłoża po fuzji pęcherzyków w celu utworzenia jednowarstwowych błon bR, zgodną z zależną od orientacji translokacją protonów przezbłonowych (17).

rys. 2 a przedstawia reprezentatywny obraz AFM podłoża, pokrytego membranami pęcherzyków zawierających bR, przygotowanego przez 10-minutową adsorpcję na podłożu. Ponieważ trudno jest uzyskać idealną jednowarstwę (100% pokrycie), zawsze między stopionymi błonami pęcherzyków występują pęknięcia lub otwory bez próbek (zwykle dziesiątki nanometrów). Te pęknięcia i otwory są wystarczająco małe, aby podkładka Au (średnica 0,5 mm) mogła je mostkować (do pomiaru transportu), ale wystarczająco duże, aby nasze pomiary AFM umożliwiły Pomiary grubości. Analiza przekroju pokazuje, że najwyższa cecha średniej wysokości wynosi ≈5,2 nm, co dobrze zgadza się z grubością pojedynczej łatki PM, wskazując na tworzenie się monowarstwy bR. Kilka białych kropek na Rys. 2 A to resztki spłaszczonych pęcherzyków na wierzchu folii. Gęstsze membrany zawierające monowarstwę bR (rys. 2 B) wynik po ≈20-minutowej adsorpcji pęcherzyków na podłożu. Fig. 2 B pozwala również na przypadkowy pomiar grubości membrany / monowarstwy (5,1 nm między markerami) z powodu pęknięcia w membranie w wyniku nadmiernego suszenia. Dłuższe czasy adsorpcji (>30 min) doprowadziły do powstania wielowarstw. Monowarstwy membran ze zmodyfikowanym bR przygotowano przy użyciu tych samych procedur. Wszystkie próbki do pomiarów transportu elektrycznego zostały przygotowane przez 20 minut adsorpcji i sprawdzone przez AFM w celu zapewnienia jakości jednowarstwowej. Warto wspomnieć, że w przeciwieństwie do powierzchniowo podtrzymywanych dwuwarstw czystych lipidów, które są niestabilne i rozpadają się po wysuszeniu (nie mówiąc już o suszeniu pod przepływem N2) z powodu utraty hydrofobowych interakcji między lipidami w stanie suchym, tak przygotowane membrany PC/bR są raczej stabilne (nawet po łagodnym wysuszeniu N2), Jak pokazują zdjęcia AFM. Przypisujemy to zjawisko wysokim ujemnym ładunkom na powierzchniach bR, które mogą silnie oddziaływać z dodatnio naładowaną powierzchnią podłoża i działać jako rusztowanie w celu usztywnienia dwuwarstw lipidowych. Interakcja ta sprawia, że dwuwarstwy są wystarczająco wytrzymałe, aby umożliwić powtarzalne i powtarzalne badania transportu elektronów w trybie jednowarstwowym w warunkach otoczenia i w temperaturze pokojowej.

rys. 2.

obrazy AFM membran zespolonych zawierających bR. (Po lewej) reprezentatywne obrazy AFM (2 × 2 µm) monowarstw stapianych błon pęcherzyków zawierających bR, wytworzonych przez 10-minutową adsorpcję na podłożu Al / AlOx, wyprowadzonych za pomocą APTMS. Skany linii (A Prawa i B prawa) pokazują średnią wysokość najsilniejszych cech ≈5,2 nm. Wysokość paska wynosi 20 nm. (B Z Lewej) bardziej gęsto upakowany bR zawierający monowarstwę, przygotowany przez 20-minutową adsorpcję pęcherzyków na podłożu (obraz 1,25- × 1,25-µm). Pęknięcie w membranie, wywołane nadmiernym wysuszeniem (coś, czego ostrożnie unikano podczas przygotowywania próbek używanych do pomiarów transportu elektrycznego) pokazuje, że monowarstwy mają grubość 5,1 nm (między markerami).

pomiary I–V przeprowadzono na płaskich konstrukcjach przyłączeniowych w pomieszczeniu czystym klasy 10000 przy 293K i wilgotności względnej 40%, z próbką umieszczoną między podłożem Al / AlOx a stykami Au. Na każdej próbce, kilka małych, 0,5-mm-Średnica podkładki Au zostały osadzone na jednowarstwowej techniką LOFO. Obwód jest zakończony przez delikatne umieszczenie Elektrody Wolframowej na złotej elektrodzie (11). Główną zaletą stosowania techniki LOFO do przygotowania kontaktu górnego, w porównaniu z osadzaniem z odparowaniem metalu lub kontaktami rtęci, jest to, że wstępnie uformowane plastry metalowe mogą unosić się i rozciągać się na kilka małych otworów i pęknięć (zwykle w dziesiątkach nanometrów), dzięki czemu pomiary elektryczne są udane. Fig. 3 A pokazuje typową charakterystykę I-V uzyskanego połączenia metal / (bR jednowarstwowa dwuwarstwowa w lipidach) / METAL w zakresie odchylenia ±1-V. Krzywe I-V zarejestrowano po zmroku, a następnie napromieniowaniu światłem zielonym (λ > 550 nm, 20 mW/cm2). W ciemności wykryto przepływ 0,75 nA przy zastosowaniu odchylenia 1-V. Po oświetleniu w stanie stacjonarnym światłem zielonym, prąd wzrasta z 0,75 do 1,7 nA Przy 1-V zastosowanym odchyleniu. Gdy zielone światło zostało zablokowane, prąd rozpadł się w ciągu 2-3 minut do pierwotnej wartości ciemnej. Możliwe, że efekt świetlny jest związany z tworzeniem fotochemicznie indukowanego półproduktu m, który może mieć wolniejszy rozkład termiczny w suchych warunkach jednowarstwowych niż w membranach w roztworze (18). Układ może być przełączany między tymi dwoma stanami przez naprzemienną adaptację światła zielonego i ciemności, co wskazuje, że preparat bR zachowuje swoją fotoaktywność. Urządzenia sterujące z tylko JEDNOWARSTWĄ APTMS wbudowaną między stykami Al / AlOx i Au były zawsze zwarte z typowymi rezystancjami przyłączeniowymi <50 Ω, co wskazuje, że warstwy AlO x są wystarczająco cienkie, aby umożliwić wiarygodne pomiary elektryczne.

rys. 3.

I–V charakterystyka połączeń metal–(bR)–metal. A) krzywe I-V złącza Au/(wild-type bR)/(APTMS–AlOx–Al) zawierającego zorientowaną jednowarstwę bR, przygotowaną przez fuzję pęcherzyków i mierzoną w warunkach otoczenia w ciemności, po oświetleniu przy λ > 550 nm, i adaptacji ciemnej. Strzałki pokazują, że odpowiedzi I-V można przełączać między dwoma stanami. Powierzchnia AU pad wynosiła 2,10-3 cm2. B) Wykres ciemnych prądów o napięciu odchylenia + 1,0 V dla ośmiu niezależnych połączeń przygotowanych odpowiednio z pęcherzyków bR / PC i z pęcherzyków bR / OTG.

kluczową rolę, jaką odgrywa bR w wytwarzaniu zmierzonych prądów przezbłonowych, zilustrowano za pomocą innej jednowarstwowej membrany o wyższej zawartości bR, która została przygotowana zgodnie z opisem w ref. 14 stosując OTG jako detergent do tworzenia pęcherzyków bR. Te dwa rodzaje jednowarstwy bR (zawierające membrany o różnej zawartości bR przygotowane z pęcherzyków bR/PC lub bR/OTG) będą oznaczone jako membrana a lub B i Złącze A lub B dla odpowiednich połączeń. Typowe absorbancje (w OD) przy ≈560 nm wynoszą odpowiednio ≈0,15 × 10-3 i ≈1,0 × 10-3 dla membrany a I B. Zawartość bR w błonie B (≈6-krotnie wyższa niż w błonie a) jest podobna do zawartości bR w suchej jednowarstwowej cząsteczce cząstek stałych, na podstawie zarówno eksperymentalnej absorbancji (18), jak i wartości obliczonej dla idealnej jednowarstwy cząstek stałych (≈1 × 10-3 OD Przy ≈560 nm). Uśrednione ciemne prądy w danym zastosowanym ukosie złączy B są prawie osiem razy większe niż w przypadku złączy A, tj. bardzo blisko proporcjonalne do zawartości bR w błonach (rys. 3 B). To odkrycie sugeruje, że elektrony przechodzą głównie przez bR przez błonę, a nie przez dwuwarstwy lipidowe. Oba połączenia A i B są fotoaktywne i po normalizacji do zawartości bR wykazują podobną charakterystykę I-V.

średni wpływ światła na natężenie przepływu prądu w połączeniach a i B wynosi zwykle ≈1 i ≈3 nA przy zastosowaniu odchylenia 1-V. Indukowana światłem zmiana prądu złącza B jest nieco niższa niż oczekiwano, w oparciu o zawartość bR w dwóch typach próbek. Różnica może wynikać z różnic w frakcjach pośredniego M, które mogą gromadzić się w próbkach A i B i / lub z różnic między dwiema próbkami w indukowanej fotoformacją zmianie konformacji białka, nałożonej przez tworzenie M.

mierzalny przepływ prądu przez białko o grubości 5 nm jest niezwykły w porównaniu z innymi podobnymi układami o tej samej szczelinie. Na przykład, zauważamy, że typowy peptyd o długości 1 nm przejdzie ≈12 nA Przy 0,5 V (19), podobnie jak ten, który przechodzi przez pojedynczy ditiol oktanowy o długości 1,2 nm (20). Wszystkie inne czynniki są równe i zakładając wykładniczy spadek prądu (tunelowego) ze wzrostem długości cząsteczki, dają prąd ≈10-23 A dla obszaru ≈35-nm2 (równoważny powierzchni jednego trymera bR plus lipidów), używając modelu Simmonsa do bezpośredniego tunelowania (porównaj sekcję 2 i fig.2 w ref. 21). Na podstawie naszych danych absorpcji optycznej szacujemy gęstość bR w naszych membranach na ≈109 trymer bR na złącze 0,002-cm2. Wartość ta przekłada się na zmierzony doświadczalnie prąd 3 × 10-19 a na trymer bR, tj., co najmniej cztery rzędy wielkości więcej niż szacuje się dla bezpośredniego tunelowania przez peptydy 5-nm, alkile lub ośrodek dielektryczny o podobnej stałej dielektrycznej. Jest zatem prawdopodobne, że proces obecnego transportu jest bardziej złożony niż proste tunelowanie przez pojedynczą barierę. Rzeczywiście, naturalne białka, których funkcja obejmuje transfer elektronów często muszą przenosić elektrony o wysokiej specyficzności kierunkowej na duże odległości. Taki transfer na większe odległości zawsze obejmuje łańcuch kofaktorów, takich jak centra redoks (22). Analogicznie do tych centrów redoks, możemy uznać siatkówkę, układ π-elektronowy, który znajduje się w centrum bR, za związek pośredni na drodze elektronów przez białko. Jeśli zamiast tunelowania przez jedną długą cząsteczkę, proces zachodzi w (co najmniej) dwóch etapach, z zdelokalizowaną stacją elektronową 2,3 nm z każdej strony, szacunki podobne do tych użytych powyżej dają prądy ≈10-20 a na 35 nm2 (21).

aby sprawdzić ten ostatni pomysł eksperymentalnie, przygotowaliśmy i zbadaliśmy połączenia błon bR wolnych od siatkówki. Aby przygotować te membrany, najpierw rozświetliliśmy białko zmieszane z hydroksyloaminą. Reakcja ta prowadzi do zerwania protonowanego wiązania zasadowego Schiffa, dając bakterioopsynę apo-białkową (BO) i retinaloksym, który pozostaje przyłączony do błony (12). Następnie retinaloksym usunięto przez wymieszanie membran apo w roztworze BSA, a następnie inkubację i odwirowanie. BSA kompetycyjnie rozpuszcza retinaloksym osadzony w błonie. Powtarzane płukania wirówek usuwają BSA po oczyszczeniu białka ze wszystkich zanieczyszczeń chromoforowych (5). Przepływ prądu przez (wolną od siatkówki) apo-membranę jest o około trzy rzędy wielkości mniejszy niż obserwowany z natywnymi błonami bR (porównaj Fig. 4 A i 3 a). Prąd był bardzo głośny i niestabilny. Wynik ten wspiera ideę, że prąd przepływa dominująco przez białka bR i że siatkówka służy jako mediator transportu prądu. Ponadto efekt fotograficzny obserwowany z natywnymi błonami zawierającymi bR można przypisać do siatkówki.

rys. 4.

I–V charakterystyka połączeń metal–apo-membrana–metal . A) typowa charakterystyka I-V połączenia z błoną Au/apo(bez siatkówki)/(APTMS-AlOx–Al) przygotowanego przez fuzję pęcherzyków i mierzonego w warunkach otoczenia. B) krzywe I-V złącza AU/APO-membrany(apo-białka bR plus retinaloksym)/(APTMS–AlOx–Al) przygotowanego przez fuzję pęcherzyków i mierzonego w warunkach otoczenia w ciemności i po oświetleniu przy λ > 550 nm. Nie zaobserwowano wpływu fotoefektu na prąd złącza.

aby sprawdzić, czy wiązanie kowalencyjne siatkówki–białka jest warunkiem koniecznym do transportu elektronów, zmierzyliśmy próbki apo-membrany zawierające retinaloksym. Co najmniej część retinaloksymu nadal zajmuje miejsce wiązania siatkówki, jak wynika z spektroskopii CD (23). Krzywe I-V takich próbek wykazały zachowanie podobne do natywnego bR pod względem aktualnej wielkości, ale nie wykazały żadnej odpowiedzi na zielone światło zgodnie z oczekiwaniami w próbkach pozbawionych absorpcji w tym regionie (Fig. 4 B). Charakterystyka I-V jest bliższa liniowej niż w przypadku próbek typu dzikiego, co może wskazywać na zmianę luki tunelowej między siatkówką a retinaloksymem.

aby rzucić dalsze światło na wpływ izomeryzacji siatkówki i fotocyklu na efekt świetlny, zbadaliśmy sztuczne pigmenty pochodzące z 13-CIS (3)-zablokowanych siatkówki (Schemat 1), gdzie krytyczny C 13osadzony Obrazizomeryzacja 1C 14 jest blokowana przez 5-członową strukturę pierścieniową (24, 25). Dla tych sztucznych pigmentów stwierdzono cechy I-V podobne do tych uzyskanych z apo-membranami z oksymem siatkówki. Brak efektu fotoefektu w połączeniach wykonanych z apo-membranami jest zgodny z brakiem fotoefektu w tych próbkach (24, 26), co potwierdza hipotezę, że występowanie izomeryzacji siatkówki jest warunkiem wstępnym efektu świetlnego. Zakładamy, że nie występuje wyraźna, indukowana polem elektrycznym, zmiana konformacyjna bR (tj. bR pozostanie natywna) w polach ≤10 6 V/cm w całym białku, które są osiągane w naszych eksperymentach. Zauważamy, że górna elektroda au jest półprzezroczysta dla zielonego światła. Na przykład folia 55 nm Au transmituje ≈70% przy ≈550 nm (27). Możliwe fizyczne pochodzenie efektu fotoefektu z nanogapu, płaskiej nanostruktury metalu, na przykład przez wzbudzenie plazmonu powierzchniowego, można bezpiecznie wykluczyć (28). Na podstawie tych i opisanych powyżej wyników, przypisujemy efekt fotoefektu na prądy przyłączeniowe do fotoizomeryzacji 13-cis / all-trans siatkówki (4) i wynikających z niej zmian konformacyjnych białek. Zauważamy, że w naszych doświadczeniach elektrony pochodzą z metalowych elektrod i przechodzą przez bR z elektrody do elektrody pod przyłożonym napięciem, przy czym bR działa jako medium przewodzenia elektronicznego. Pod tym względem bR różni się od układów takich jak fotosyntetyczne centra reakcji, w których transfer elektronów między kofaktorami jest fotoindukowany.

wynika to z obliczeń i na przykład z ujemnego wyniku rys. 4 a że mechanizm nie jest (tylko) bezpośrednim tunelowaniem. Jest również mało prawdopodobne, aby być (wyłącznie) jednym z hopping w świetle (pojedynczej cząsteczki) wyniki pracy Selzer et al. (29). Jak więc elektrony mogą przenikać przez białko? Nasze wyniki doświadczalne wyraźnie wskazują, że chromofor siatkówki jest niezbędnym składnikiem procesu przewodzenia. Powszechnie wiadomo, że siatkówka jest połączona ze stroną zewnątrzkomórkową za pomocą sieci wiązanej H, która prawdopodobnie zapewnia elektrostatycznie ekranowaną ścieżkę do transportu ładunku. Ponieważ istnieje również dobre połączenie między stroną siatkówki i zewnątrzkomórkową w ciemności, ścieżka ta musi być obecna niezależnie od oświetlenia. Jego obecność może wyjaśnić wyższe niż oczekiwane prądy, które mierzymy. Wiadomo, że połączenie siatkówki z powierzchnią cytoplazmatyczną jest aktywowane światłem, co może wyjaśniać efekt świetlny, który obserwujemy. Obie te sugestie wymagają dalszego dochodzenia.

znaczenie transferu ładunku między chromoforem siatkówki a środowiskiem białkowym dla bR w stanie podstawowym zostało zasugerowane, w oparciu o teorię, przez Sakai i wsp. (30). Autorzy Ci wysunęli hipotezę, że chromofor jest stabilizowany w bR przez interakcję jego najwyższych zajętych i najniższych nieobsadzonych orbitali molekularnych ze środowiskiem białkowym. Jeśli wystarczający ładunek jest przenoszony między dwoma miejscami, ze względu na silne oddziaływanie orbitali molekularnych o najwyższym zajętym–NAJNIŻSZYM zajętym, chromofor (π-sprzężony) może być postrzegany jako gatunek o zredukowanym/utlenionym jednym elektronie (jeśli zachowuje się jako akceptor/dawca elektronów). Najbardziej prawdopodobną interakcję chromofor-białko obliczono za pośrednictwem sieci wiązanej H wzdłuż domniemanego szlaku protonowego.

kuszące jest również sugerowanie, że transport elektronów sprzężonych z protonem (22, 31) odgrywa pewną rolę, ponieważ w kanale protonowym bR (32, 33) znajdują się niby jednowymiarowe protonowane łańcuchy wodne osadzone w dwuwarstwach lipidowych, które będą normalne dla dwóch elektrod w naszym Układzie (17). Ta sugestia może wyjaśnić część różnicy między transportem elektronów przez bR I przez rzekomo wolne od wody peptydy. W związku z taką sytuacją pojawia się kilka pytań.

  1. ile, jeśli w ogóle, może transport elektronów przez bR skorzystać z wbudowanego kanału protonowego?

  2. W Jaki Sposób chromofor i struktura białek interferujących wpłynie na szybkość transportu elektronów dalekiego zasięgu?

  3. w jakim stopniu wiązane cząsteczki wody wewnątrz bR mogą przyczynić się do prądu elektronicznego?

Możliwe, że zależne od temperatury pomiary I-V, choć nie są one trywialne w tym systemie, mogą rzucić światło na te kwestie.

zauważamy, że w przeciwieństwie do przypadku monowarstwy bR w roztworze Fotokurrent Faradaiczny suchej monowarstwy bR pochodzący z translokacji protonu przezbłonowego jest znikomy w porównaniu z obserwowanymi prądami przyłączeniowymi, ponieważ źródło protonu jest ograniczone. Nasze odkrycie, że wszystkie obserwowane prądy przyłączeniowe (w ciemności lub pod zielonym światłem) są zerowe, w ramach błędu eksperymentalnego , potwierdza brak translokacji protonów w stanie stacjonarnym. Nie ma zatem mierzalnej fotoresponse między około ±30 mV przy ≈0 V (cf. Nr ref. 34; każde ogniwo fotowoltaiczne ≤15-20 mV znajduje się w szumie naszego pomiaru), co wskazuje, że napędzana światłem translokacja protonów przez monowarstwę bR trzymaną między elektrodami w nieznacznym stopniu przyczynia się do prądów światła w stanie ustalonym. Wniosek ten został potwierdzony przez fotokurrenty bR indukowane przez translokację protonów w podobnych dwuwarstwach lipidowych opartych na ciele stałym (zwykle 4-8 nA/cm2) (18), które są o dwa do trzech rzędów wielkości mniejsze niż prądy przyłączeniowe, które tutaj mierzymy (≈0,5–5 µA/cm2). Mimo to, nawet bez żadnego bezpośredniego związku między transportem protonów i elektronów, zauważamy, że białko, które z punktu elektrostatyki (przesiewania) nadaje się do przenoszenia protonów, może być w stanie użyć tego samego mechanizmu przesiewania w celu ułatwienia transportu elektronów.

możemy również porównać nasze wyniki z wcześniej zgłoszonymi fotokurrentami przez wielowarstwy suche ≈500 nm (8) i ≈100 µm (9), obliczając wartości na JEDNOWARSTWĘ cząstek stałych (5 nm). Taka normalizacja daje wartości ≈0,01 nA na pojedynczą warstwę PM na cm2, tj., około cztery do pięciu rzędów wielkości mniej niż prądy łączące, które tutaj mierzymy (≈0,5-5 µA / cm2). Ta dramatyczna różnica ilustruje trudności w interpretacji wcześniejszych, pionierskich pomiarów (9) i podkreśla znaczenie stosowania tak dobrze zdefiniowanej konfiguracji, jak to możliwe do pomiarów transportu elektronów w systemach biologicznych. Dzięki takim konfiguracjom możliwe staje się również wykonywanie pomiarów w funkcji kontrolowanych zmian systemu.

wyniki i dyskusja przygotowano zawiesinę fragmentów PM zawierających bR typu dzikiego (12) i odtworzono z egzogenną fosfatydylocholiną jaja (PC) do pęcherzyków przez modyfikację metody Rackera (13). W celu dalszego sprawdzenia charakterystyki prądowo-napięciowej zależnej od ilości białka (I–V) przygotowano inną pęcherzykową zawiesinę bR, stosując oktylotioglukozyd (OTG) jako detergent (14). Monowarstwy rodzimych membran zawierających bR otrzymano następnie…

wyniki i dyskusja przygotowano zawiesinę fragmentów PM zawierających bR typu dzikiego (12) i odtworzono z egzogenną fosfatydylocholiną jaja (PC) do pęcherzyków przez modyfikację metody Rackera (13). W celu dalszego sprawdzenia charakterystyki prądowo-napięciowej zależnej od ilości białka (I–V) przygotowano inną pęcherzykową zawiesinę bR, stosując oktylotioglukozyd (OTG) jako detergent (14). Monowarstwy rodzimych membran zawierających bR otrzymano następnie…

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.