Bacteriorhodopsin (bR) jako elektronický vodivosti médium: Aktuální doprava přes bR-monovrstvy obsahující

Výsledky a Diskuse

pozastavení PM fragmenty obsahující wild-type bR byl připraven (12) a rekonstituované s exogenní vaječný fosfatidylcholin (PC) do váčků změnou způsobu Racker (13). Pro další kontrolu charakteristik proudového napětí závislého na množství proteinu (I-V) byla připravena další vezikulární suspenze bR použitím oktylthioglukosidu (OTG) jako detergentu (14). Monovrstvy nativní bR-obsahující membrány pak byly připravené vezikuly adsorbují na Al podkladu (≈50 nm silný film Al odpaří na křemen) s vrstvou přírodního oxidu hlinitého na svém povrchu (zde zastoupeny jak AlOx). Připojené vezikuly se pak otevřou a spojí a vytvoří lipidové dvojvrstvy s pevnou podporou. Pro podporu elektrostatické adsorpce vezikul jsme nejprve silanizovali povrch substrátu (3-aminopropyl)trimethoxysilanem (APTMS) (15), následovaným zpracováním 0,1 M HCl, abychom získali kladně nabitý povrch. Obě suspenze vezikul bR / PC nebo bR / OTG vykazovaly světlo indukované čerpání protonů dovnitř ,jak bylo zjištěno dříve (13, 16). Na základě tohoto pozorování, předpokládáme přednostní orientace bR s cytoplazmatické straně směrem k povrchu substrátu po váčku fusion tvořit bR jednovrstvé membrány, v souladu s orientací-dependentní transmembránový protonové translokace (17).

Obr. 2 ukazuje typické AFM obraz substrátu, na které se vztahuje bR-obsahující taveného váček membrán, připravených 10-min adsorpce na substrátu. Protože je obtížné získat ideální monovrstva (100% pokrytí), tam jsou vždy nějaký vzorek-toaletní trhlin nebo dírek (typicky desítky nanometrů), mezi pojistkou vezikulární membrány. Tyto trhliny a dírky jsou dostatečně malé, pro Au-pad (0.5 mm průměr), na můstku (pro dopravní měření), ale dostatečně velké pro naše AFM měření, aby se měření tloušťky možné. Sekce analýza ukazuje nejvyšší průměrná výška funkci musí být ≈5.2 nm, což dobře souhlasí s tloušťkou jednoho PM patch, což naznačuje vznik bR monovrstva. Několik bílých teček na obr. 2 A jsou ponechány zploštělé vezikuly na horní části filmu. Hustší membrány obsahující br monovrstvu (obr. 2 B) výsledek po ≈20-min adsorpci vezikul na substrátu. Obr. 2 B také umožňuje náhodné měření tloušťky membrány / monovrstvy (5,1 nm mezi markery) z důvodu trhliny v membráně v důsledku nadměrného sušení. Delší doby adsorpce (>30 min) vedly k vícevrstvé tvorbě. Monovrstvy membrán s modifikovaným bR byly připraveny stejnými postupy. Všechny vzorky pro měření elektrického transportu byly připraveny 20 minut adsorpce a zkontrolovány AFM, aby byla zajištěna kvalita jednovrstvé. Stojí za zmínku, že, na rozdíl od povrchu-podporované čisté lipidové dvojvrstvy, které jsou nestabilní a rozpadají při sušení (natož sušení pod N2 průtok) kvůli ztrátě hydrofobních interakcí mezi lipidy v suchém stavu, jak je připraven PC/bR membrány jsou spíše stabilní (i po mírné N2-sušení), jak bylo zjištěno pomocí AFM obrázky. Jsme připisují tento jev na vysoké záporné náboje na bR povrchy, které mohou interagovat silně s kladně nabité povrchu substrátu a působí jako lešení pro vyztužení lipidové dvojvrstvy. Tato interakce je dvojvrstvy dostatečně robustní, aby umožnila opakované a opakovatelné elektronový transport studium v jednovrstvé móda podle okolních podmínek a při pokojové teplotě.

Obr. 2.

AFM obrázky fúzovaných membrán obsahujících bR. (Vlevo) Zástupce AFM obrázky (2 × 2 µm) monovrstvy z taveného membrány bR-obsahující váčky, připraví se 10-min adsorpce na Al/AlOx substrátu, derivatizován s APTMS. (A vpravo a B vpravo) řádkové skenování ukazující průměrnou výšku nejsilnějších vlastností ≈5,2 nm. Výšková lišta pokrývá 20 nm. (B vlevo) hustěji zabalený bR obsahující monovrstvu, připravený 20minutovou adsorpcí vezikul na substrátu (obrázek 1,25 – × 1,25-µm). Trhliny v membráně, vyvolané nadměrné sušení (něco, co bylo pečlivě vyhnout při přípravě vzorků použitých pro elektrické transportní měření) ukazuje, jednovrstvé být 5.1 nm tlusté (mezi značkami).

I–V měření bylo provedeno na planárních křižovatce struktur ve třídě-10000 čisté místnosti při 293K a 40% relativní vlhkosti, se vzorkem vložena mezi Al/AlOx substrátu a Au kontakty. Na každém vzorku bylo technikou LOFO naneseno na monovrstvu několik malých Au polštářků o průměru 0,5 mm. Obvod je dokončen jemným umístěním wolframové elektrody na zlatou elektrodu (11). Hlavní výhodou použití LOFO technika připravit horní kontakt, ve srovnání s kovy odpařovací depozice nebo rtuť kontakty, je, že vytvarované kovové záplaty mohou vznášet se na a span některé malé dírky a trhliny (obvykle v desítkách nanometrů), což elektrická měření úspěšné. Obr. 3 a vykazuje typické I – v charakteristiky výsledného spojení kov/(br monovrstva v lipidové dvojvrstvě) / kov v rozmezí ± 1-V. I-v křivky byly zaznamenány po tmavé rovnováze následované ozářením zeleným (λ > 550 nm, 20 mW/cm2) světlem. Ve tmě bylo zjištěno 0,75 na toků při 1-V aplikovaném zkreslení. Po ustáleném osvětlení zeleným světlem se proud zvyšuje z 0,75 na 1,7 nA při aplikovaném zkreslení 1-V. Jakmile bylo zelené světlo zablokováno, proud se rozpadl během 2-3 minut na původní tmavou hodnotu. Možná, světelný efekt je spojena s tvorbou photochemically vyvolané M intermediate, že může mít pomalejší tepelného rozkladu pod suché jednovrstvé podmínky než v membránách v roztoku (18). Systém lze cyklovat mezi těmito dvěma stavy střídáním adaptace zeleného světla a tmy, což naznačuje, že bR si zachovává svou fotoaktivitu. Ovládací zařízení s pouze APTMS jednovrstvé začleněna mezi Al/AlOx a Au kontakty byly vždy zkratován s typickými křižovatce odpory <50 Ω, což znamená, že AlO x vrstev jsou dostatečně tenké pro spolehlivé elektrické měření.

Obr. 3.

I-v charakteristiky spojů kov – (br monovrstva) – kov. (A) I–V křivky Au/(wild-type bR)/(APTMS–AlOx–Al) spojovací obsahující orientované bR jednovrstvé, připravil vezikulární fúze a měří při okolní podmínky, ve tmě, při osvětlení při λ > 550 nm, a tmavé adaptace. Šipky ukazují, že I–v odpovědi mohou být cyklovány mezi oběma stavy. Plocha Au pad byla 2,10 – 3 cm2. (B) Graf tmavých proudů při předpětí + 1,0-V pro osm nezávislých spojů připravených z vezikul bR/PC a z vezikul bR/OTG.

klíčovou roli, kterou bR hraje při výrobě měřených transmembránových proudů, je ilustrováno použitím jiné jednovrstvé membrány s vyšším obsahem bR, která byla připravena podle ref. 14 použitím OTG jako detergentu pro tvorbu bR vezikul. Tyto dva druhy br monovrstvy (obsahující membrány s různým obsahem bR připravené z vezikul bR/PC nebo bR/OTG) budou označeny jako membrána a nebo B a křižovatka a nebo B pro odpovídající křižovatky. Typické absorbance (v OD) při ≈560 nm jsou ≈0,15 × 10-3 a ≈1,0 × 10-3 pro membránu a A B. V bR obsahu membrány B (≈6-krát vyšší, než membrána) je podobná bR v suché PM jednovrstvé, založené na experimentální absorbance (18) a hodnota, vypočtena pro ideální HODIN monovrstva (≈1 × 10-3 OD v ≈560 nm). V průměru temné proudy v daném aplikovat bias křižovatek B jsou téměř osmkrát ty, které našel s uzly, tj. velmi úzce úměrná bR obsahu v membránách (Obr. 3 B). Toto zjištění naznačuje, že elektrony procházejí hlavně přes bR přes membránu spíše než přes lipidové dvojvrstvy. Obě křižovatky A A B jsou fotoaktivní a při normalizaci na obsah bR vykazují podobné I – v charakteristiky.

průměr světelné efekty na proudu uzly a a B jsou obvykle ≈1 a ≈3 nA na 1-V aplikovaná zkreslení, resp. Světlem indukovaná změna proudu B je o něco nižší, než se očekávalo, na základě obsahu bR obou typů vzorků. Rozdíl by mohl být způsoben rozdíly ve zlomcích M meziproduktů, které se mohou hromadit ve vzorcích a a B a/nebo s rozdíly mezi dvěma vzorky v foto-indukované proteinové konformace změnit, uložené M formaci.

měřitelný proudový průtok proteinem o tloušťce 5 nm je pozoruhodný ve srovnání s jinými podobnými systémy se stejnou mezerou. Například si všimneme, že typický 1-nm dlouhý peptid projde ≈12 na při 0,5 V (19), podobný tomu, který prošel jedním 1,2-nm dlouhým oktanovým dithiolem (20). Všechny ostatní faktory jsou stejné a za předpokladu exponenciální pokles (tunel) proud s rostoucí molekuly délka, výnosy proud ≈10-23 pro e ≈35-nm2 oblasti (což odpovídá rozloze jednoho bR trimer plus lipidy), pomocí Simmons model pro přímé tunelování (viz oddíl 2 a obrázek 2 v ref. 21). Na základě našich optických absorpčních dat odhadujeme hustotu bR v našich membránách na ≈109 br trimer na křižovatku 0,002-cm2. Tato hodnota se promítá do experimentálně měřeného proudu 3 × 10-19 a na br trimer, tj. nejméně čtyři řády více, než se odhaduje pro přímé tunelování přes 5-nm peptidy, alkyly, nebo dielektrikum s podobnými dielektrickou konstantou. Je tedy pravděpodobné, že proces současné dopravy je složitější než přímé tunelování přes jednu bariéru. Přírodní proteiny, jejichž funkce zahrnuje přenos elektronů, často potřebují přenášet elektrony s vysokou směrovou specificitou na velké vzdálenosti. Takový přenos na delší vzdálenosti vždy zahrnuje řetězec kofaktorů, jako jsou redoxní centra (22). V analogii k těmto redox center, můžeme považovat sítnice, π-elektronový systém, který je v centru bR, jako meziprodukt na cestě elektronů přes protein. Pokud je místo tunelování prostřednictvím jedné dlouhé molekuly, tento proces se vyskytuje v (nejméně) dvou krocích, s delokalizována elektron cesta-nádraží 2.3 nm z každé strany, odhady podobné těm, které používají výše proudy ≈10-20 za 35 nm2 (21) .

abychom experimentálně zkontrolovali tuto poslední myšlenku, připravili jsme a zkoumali spojení membrán br bez sítnice. Pro přípravu těchto membrán jsme nejprve osvětlili protein smíchaný s hydroxylaminem. Tato reakce vede k lámání protonované Schiffovy báze vazba, získávání apo-protein bacterioopsin (BO) a retinaloxime, která zůstává připojena k membráně (12). Retinaloxim byl poté odstraněn resuspendací apo-membrán v roztoku BSA, následovanou inkubací a centrifugací. BSA kompetitivně solubilizuje retinaloxim, který je vložen do membrány. Opakovaná promývání odstředivky odstraní BSA, jakmile je protein vyčištěn ze všech kontaminantů chromoforu (5). Proudový průtok apo-membránou (bez sítnice) je přibližně o tři řády nižší, než byl pozorován u nativních br membrán(porovnejte obr. 4 A a 3 A). Proud byl velmi hlučný a nestabilní. Tento výsledek podporuje myšlenku, že proud dominantně protéká proteiny bR a že sítnice slouží jako současný transportní mediátor. Kromě toho lze fotografický efekt pozorovaný u nativních membrán obsahujících bR připsat sítnici.

Obr. 4.

I-v charakteristiky spojení kov-apo-membrána-kov. A) typická I – v charakteristika spojení Au/apo-membrána(bez sítnice)/(APTMS-AlOx–Al) připravená fúzí vezikul a měřená za okolních podmínek. (B) I–V křivky Au/apo-membrána (apo-protein bR plus retinaloxime)/(APTMS–AlOx–Al) spojovací připravené vezikulární fúze a měří při okolní podmínky, ve tmě a na osvětlení při λ > 550 nm. Nebyl pozorován žádný fotoefekt na spojovací proud.

zkontrolujte, zda je sítnice–proteinu kovalentní vazba je předpokladem pro elektronový transport, měřili jsme apo-membrána vzorky obsahující retinaloxime. Alespoň část retinaloximu bude stále zabírat vazebné místo sítnice, jak je odvozeno z CD spektroskopie (23). I–V křivky těchto vzorků vykazovala chování podobné nativní bR, pokud jde o aktuální velikosti, ale oni nevykazují žádnou odpověď na zelené světlo, jak se očekávalo, ve vzorcích chybí absorpce v této oblasti (Obr. 4 B). Charakteristiky I–V jsou blíže lineární než to, co najdeme u vzorků divokého typu, což může naznačovat změnu tunelovací mezery mezi sítnicí a retinaloximem.

vrhnout další světlo na efekt sítnice izomerace a photocycle na světlo, účinek, jsme studovali umělé pigmenty odvozené od 13-cis (3)-zamčené retinals (Schéma 1), kde kritického C 13 Embedded Image1C 14 izomerace je blokován 5-členný kruh strukturu (24, 25). I-v vlastnosti podobné těm, které byly získány s apo-membránami s oximem sítnice, se nacházejí u těchto umělých pigmentů. Nedostatek fotoefekt v křižovatkách vyrobeny s apo-membrány je v souladu s absencí photocycle v těchto vzorků (24, 26), které podporují hypotézu, že výskyt sítnice izomerace je předpokladem pro světelný efekt. Předpokládáme, že v polích ≤106 V/cm napříč proteinem, které jsou dosaženy v našich experimentech, nedochází k žádné výrazné konformační změně vyvolané elektrickým polem (tj. Všimneme si, že Au top elektroda je poloprůhledná pro zelené světlo. Například 55 nm Au film přenáší ≈70% při 550 550 nm (27). Možné fyzické původu fotoefekt z nanogap, rovinné, kov již sám, například tím, že surface plasmon buzení, lze bezpečně vyloučit (28). Na základě těchto a výše popsaných výsledků připisujeme fotoefekt na spojovací proudy fotoizomeraci 13-cis / all-trans sítnice (4) a konformačním změnám proteinů, které z ní vyplývají. Bereme na vědomí, že v našich experimentech elektrony pocházejí z kovové elektrody a projít bR z elektrody na elektrodu pod aplikovaná napětí, s bR chová jako elektronický vedení střední. V tomto ohledu se bR liší od systémů, jako jsou fotosyntetická reakční centra, ve kterých je přenos elektronů mezi kofaktory fotoindukován.

je zřejmé z výpočtů a například z negativního výsledku na obr. 4 a že mechanismus není (pouze) jedním z přímého tunelování. Je také nepravděpodobné ,že by to byl (pouze) jeden z poskakování s ohledem na výsledky (jediné molekuly)práce Selzera a kol. (29). Jak tedy mohou elektrony procházet proteinem? Naše experimentální výsledky jasně ukazují, že retinální chromofor je nezbytnou součástí procesu vedení. Je dobře známo, že sítnice je připojen na extracelulární straně přes H-vázané sítě, která pravděpodobně poskytuje elektrostaticky promítán cesta na starosti dopravu. Protože existuje také dobré spojení mezi sítnicí a extracelulární stranou ve tmě, musí být tato cesta přítomna bez ohledu na osvětlení. Jeho přítomnost může vysvětlit vyšší než očekávané proudy, které měříme. Je známo, že spojení sítnice s cytoplazmatickým povrchem je aktivováno světlem, což může vysvětlit světelný efekt, který pozorujeme. Oba tyto návrhy vyžadují další vyšetřování.

význam přenosu náboje mezi chromoforem sítnice a proteinovým prostředím pro bR v jeho základním stavu navrhl na základě teorie Sakai et al. (30). Tito autoři předpokládali, že chromofor je stabilizován v bR interakcí jeho nejvyšších obsazených a nejnižších neobsazených molekulárních orbitalů s proteinovým prostředím. Pokud dostatečnou péči, je převedena mezi dvě stránky, kvůli silnému nejvyšší obsazené–nejnižší neobsazený molekulový orbital interakce (π-konjugované) chromofor může být viděn jako jeden elektron-snížená/-oxiduje druhů (pokud se chová jako elektron akceptor/donor). Nejpravděpodobnější interakce chromoforu a proteinu byla vypočtena prostřednictvím sítě vázané na H podél předpokládané protonové dráhy.

To je také lákavé naznačují, že proton-spolu elektronový transport (22, 31) hraje roli, protože tam jsou kvazi-jednorozměrné protonované vody řetězců v proton kanál bR (32, 33) vložené v pevných podporované lipidové dvojvrstvy, která bude kolmá k dvěma elektrodami v našich set-up (17). Tento návrh může vysvětlit část rozdílu mezi transportem elektronů přes bR a přes údajně bezvodé peptidy. Vzhledem k takové situaci vyvstává několik otázek.

  1. kolik, pokud vůbec, může elektronový transport přes bR těžit z vestavěného protonového kanálu?

  2. Jak ovlivní chromofor a zasahující proteinová struktura rychlost přenosu elektronů s dlouhým dosahem?

  3. do jaké míry mohou vázané molekuly vody uvnitř bR přispívat k elektronickému proudu?

je možné, že měření I-V závislá na teplotě, i když u tohoto systému nejsou zdaleka triviální, mohou tyto problémy osvětlit.

Jsme na vědomí, že, na rozdíl od případu pro bR monovrstva v roztoku, Faradaic photocurrent suché bR jednovrstvé pocházející z transmembránové protonové translokace je zanedbatelný ve srovnání s pozorované křižovatce proudy, protože proton zdroj je omezený. Naše zjištění, že všechny pozorované spojovací proudy (v tmavém nebo zeleném světle) jsou nulové, v rámci experimentální chyby podporuje nepřítomnost translokace protonů v ustáleném stavu. Neexistuje tedy žádná měřitelná fotoreportáž mezi přibližně ±30 mV při ≈0 V (srov. odkaz. 34; jakékoliv ≤15 – až 20-mV photovoltage je v hluku našeho měření), což naznačuje, že světlo řízené protonové translokace přes bR jednovrstvé konat mezi elektrodami přispívá zanedbatelně, aby v ustáleném stavu světelné proudy. Tento závěr byl potvrzen protonové translokace-indukované bR photocurrents v podobné pevný-podporované lipidové dvojvrstvy (obvykle 4-8 nA/cm2) (18), které jsou dva až tři řády nižší, než je křižovatka proudy, které měříme zde (≈0.5–5 µA/cm2). Stále, a to i bez jakékoli přímé souvislosti mezi proton a elektron dopravy, musíme poznamenat, že protein, který, z hlediska elektrostatiky (screening), je vhodný k přenosu protonu, může dobře být schopni používat stejný mechanismus promítání pro usnadnění transportu elektronů.

také můžeme porovnat naše výsledky s již dříve oznámil, photocurrents přes ≈500 nm (8) a ≈100-µm (9) suché vícevrstvé výpočtem hodnoty na PM monovrstva (5 nm). Taková normalizace poskytuje hodnoty ≈0,01 nA na jednu vrstvu PM na cm2, tj., o čtyři až pět řádů méně než spojovací proudy, které zde měříme (≈0,5-5 µA / cm2). Tento dramatický rozdíl ilustruje obtíže při interpretaci dříve, průkopnické měření (9) a zdůrazňuje význam využívání jako dobře definované konfigurace, jak je to možné pro elektron transportní měření biologických systémů. U takových konfigurací je pak také možné provádět měření jako funkci řízených variací systému.

Výsledky a Diskuse pozastavení PM fragmenty obsahující wild-type bR byl připraven (12) a rekonstituované s exogenní vaječný fosfatidylcholin (PC) do váčků změnou způsobu Racker (13). Pro další kontrolu charakteristik proudového napětí závislého na množství proteinu (I-V) byla připravena další vezikulární suspenze bR použitím oktylthioglukosidu (OTG) jako detergentu (14). Monovrstvy nativní bR-obsahující membrány pak byly připravené…

Výsledky a Diskuse pozastavení PM fragmenty obsahující wild-type bR byl připraven (12) a rekonstituované s exogenní vaječný fosfatidylcholin (PC) do váčků změnou způsobu Racker (13). Pro další kontrolu charakteristik proudového napětí závislého na množství proteinu (I-V) byla připravena další vezikulární suspenze bR použitím oktylthioglukosidu (OTG) jako detergentu (14). Monovrstvy nativní bR-obsahující membrány pak byly připravené…

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.