Bacteriorhodopsin (bR) som et elektronisk ledningsmedium: Strømtransport gennem bR-holdige monolag

resultater og diskussion

en suspension af PM-fragmenter indeholdende vildtype bR blev fremstillet (12) og rekonstitueret med eksogent ægphosphatidylcholin (PC) til vesikler ved en modifikation af Racermetoden (13). For yderligere at kontrollere proteinmængdeafhængige strømspændingsegenskaber (i–V) blev en anden vesikulær bR–suspension fremstillet ved anvendelse af octylthioglucosid (OTG) som vaskemiddel (14). Monolag af de native br-holdige membraner blev derefter fremstillet ved at adsorbere vesiklerne på et al-substrat (en 50-nm-tyk film af al fordampet på kvarts) med et lag af naturlig aluminiumsilte på overfladen (repræsenteret her som Aloks). De vedhæftede vesikler åbnes derefter og smelter sammen og danner solid-understøttede lipid-dobbeltlag. For at fremme elektrostatisk adsorption af vesiklerne silaniserede vi først substratoverfladen med (3-aminopropyl)trimethoksilan (APTMS) (15) efterfulgt af behandling med 0,1 M HCI for at opnå en positivt ladet overflade. Både bR / PC-eller bR / OTG-vesikelsuspensioner viste lysinduceret indadgående protonpumpning som tidligere fundet (13, 16). Baseret på denne observation postulerer vi en præferenceorientering af bR med den cytoplasmatiske side vendt mod substratoverfladen efter vesikelfusion til dannelse af bR-monolagsmembraner, i overensstemmelse med orienteringsafhængig transmembran protontranslokation (17).

Fig. 2 A viser et repræsentativt AFM-billede af et substrat, der er dækket af bR-holdige smeltede vesikelmembraner, fremstillet ved 10 min adsorption på substratet. Fordi det er svært at få et ideelt monolag (100% dækning), er der altid nogle prøvefrie revner eller pinholes (typisk Titus nanometer) mellem smeltede vesikelmembraner. Disse revner og huller er små nok til, at Au-puden (0,5 mm diameter) kan bygge bro over dem (til transportmåling), men store nok til, at vores AFM-målinger muliggør tykkelsesmålinger. Sektionsanalyse viser, at den højeste gennemsnitlige højdefunktion er 5,2 nm, hvilket stemmer Godt overens med tykkelsen på en enkelt PM-patch, hvilket indikerer dannelsen af et bR-monolag. De få hvide prikker i Fig. 2 A er resterende fladede vesikler oven på filmen. Tættere br-monolagholdige membraner (Fig. 2 B)resultat efter 20 minutters adsorption af vesiklerne på substratet. Fig. 2 B tillader også en tilfældig måling af membran/monolagstykkelsen (5,1 nm mellem markører) på grund af en revne i membranen som følge af overdreven tørring. Længere adsorptionstider (>30 min) førte til dannelse af flere lag. Monolag af membraner med modificeret bR blev fremstillet ved anvendelse af de samme procedurer. Alle prøver til elektriske transportmålinger blev fremstillet ved 20 min adsorption og kontrolleret af AFM for at sikre monolagskvalitet. Det er værd at nævne, at i modsætning til overfladestøttede rene lipid-dobbeltlag, som er ustabile og vil opløses ved tørring (endsige tørring under N2-strømning) på grund af tab af hydrofobe interaktioner mellem lipider i tør tilstand, er de som fremstillede PC/bR-membraner ret stabile (selv efter mild N2-tørring), som afsløret af AFM-billeder. Vi tilskriver dette fænomen de høje negative ladninger på bR-overflader, som kan interagere stærkt med den positivt ladede substratoverflade og fungere som et stillads for at stive lipid-dobbeltlagene. Denne interaktion gør dobbeltlagene tilstrækkeligt robuste til at tillade gentagne og reproducerbare elektrontransportundersøgelser på monolagsmode under omgivende forhold og ved stuetemperatur.

Fig. 2.

AFM-billeder af BR-holdige smeltede membraner. (A til venstre) repræsentative AFM-billeder (2 liter 2 liter) af monolag af smeltede membraner af bR-holdige vesikler, fremstillet ved 10-min adsorption på Al/Aloks-substrat, derivatiseret med APTMS. (A til højre og B til højre) Linjescanninger, der viser en gennemsnitlig højde på de stærkeste træk på 5,2 nm. Højdestangen dækker 20 nm. (B til venstre) en mere tæt pakket bR indeholdende et monolag, fremstillet ved 20-min adsorption af vesikler på substratet (1,25 – liter 1,25-liter billede). Revnen i membranen, induceret af overdreven tørring (noget, der omhyggeligt blev undgået ved fremstillingen af prøverne anvendt til elektriske transportmålinger) viser, at monolaget er 5,1 nm tykt (mellem markører).

i–V målinger blev udført på plane krydsstrukturer i et klasse-10000 rent rum ved 293k og 40% relativ fugtighed, med prøven klemt inde mellem Al/Aloks-substratet og Au-kontakterne. På hver prøve blev flere små Au-puder med en diameter på 0,5 mm deponeret på monolaget ved LOFO-teknikken. Kredsløbet afsluttes ved forsigtigt at placere en tungstenelektrode på guldelektroden (11). Den største fordel ved at bruge LOFO-teknikken til at forberede topkontakt sammenlignet med metalinddampningsaflejring eller kviksølvkontakter er, at de præformede metalplaster kan flyde på og spænde over nogle små pinholes og revner (typisk i snesevis af nanometer), hvilket gør elektriske målinger vellykkede. Fig. 3 A viser typiske i-V-karakteristika for et resulterende metal / (bR monolag-i-lipid dobbeltlag) / metalkryds over et volumetrisk 1-V forspændingsområde. I – V-kurverne blev registreret efter mørk ækvilibrering efterfulgt af bestråling med grønt (pri > 550 nm, 20 mv/cm2) lys. I mørket blev 0,75 na-strømme ved en 1-V anvendt bias detekteret. Efter steady-state belysning med grønt lys øges strømmen fra 0,75 til 1,7 nA ved en 1-V anvendt bias. Når det grønne lys var blokeret, forfaldt strømmen over 2-3 minutter til sin oprindelige mørke værdi. Muligvis er lyseffekten forbundet med dannelsen af det fotokemisk inducerede m-mellemprodukt, der meget vel kan have et langsommere termisk henfald under tørre monolagsbetingelser end i membraner i opløsning (18). Systemet kan cykles mellem disse to tilstande ved skiftevis grønt lys og mørk tilpasning, hvilket indikerer, at bR-præparatet bevarer sin fotoaktivitet. Betjeningsanordninger med kun et aptms-monolag indbygget mellem Al / Aleks og Au-kontakter blev altid kortsluttet med typiske krydsningsmodstande < 50 liter, hvilket indikerer, at lagene er tynde nok til pålidelige elektriske målinger.

Fig. 3.

I–V Karakteristik af metal–(bR monolag)–metal kryds. (A) i–V-kurver af et au/(vildtype bR)/(aptms–Aloks–Al) kryds, der indeholder orienteret bR-monolag, fremstillet ved vesikelfusion og målt ved omgivende forhold i mørke, ved belysning ved Karr > 550 nm, og mørk tilpasning. Pilene viser, at I–V-svarene kan cykles mellem de to tilstande. Au pad-området var 2,10 – 3 cm2. (B) Plot af mørke strømme ved en +1,0-V bias spænding for otte uafhængige kryds fremstillet ud fra bR/PC vesikler og fra bR/OTG vesikler, henholdsvis.

den afgørende rolle, som bR spiller i produktionen af de målte transmembranstrømme, illustreres ved anvendelse af en anden monolagsmembran med højere bR-indhold, som blev fremstillet som rapporteret i ref. 14 ved anvendelse af OTG som vaskemiddel til dannelse af BR-vesikler. Disse to slags bR-monolag (indeholdende membraner med forskelligt bR-indhold fremstillet ud fra bR/PC eller bR/OTG vesikler) vil blive noteret som membran a eller B og kryds a eller B for tilsvarende kryds. De typiske absorbanser (i OD) ved hhv.560 nm er hhv. 0,15 hhv. 10-3 og hhv. 1,0 hhv. 10-3 for hhv. membran A og B. Br-indholdet i membran B (6 gange højere end for membran a) svarer til bR-indholdet i et tørt PM-monolag, baseret på både den eksperimentelle absorbans (18) og værdien beregnet for et ideelt PM-monolag (liter 1 liter 10-3 OD ved liter 560 nm). Gennemsnitlige mørke strømme ved en given anvendt bias af Kryds B er næsten otte gange dem, der findes med kryds a, dvs.meget tæt proportional med bR-indholdet i membranerne (Fig. 3 B). Dette fund antyder, at elektroner hovedsageligt passerer via bR gennem membranen snarere end gennem lipid-dobbeltlagene. Begge kryds A og B er fotoaktive og viser, når de normaliseres til bR–Indhold, lignende i-v-egenskaber.

de gennemsnitlige lyseffekter på den aktuelle strømning af kryds A og B er typisk henholdsvis kr1 og kr3 nA ved en 1-V anvendt bias. Den lysinducerede ændring i Kryds b-strøm er noget lavere end forventet, baseret på bR-indholdet af de to typer prøver. Forskellen kan skyldes forskelle i fraktionerne af M-mellemproduktet, der kan akkumuleres i prøver A og B og/eller med forskelle mellem de to prøver i den fotoinducerede proteinkonformationsændring, pålagt ved M-dannelse.

målbar strømstrøm gennem det 5-nm tykke protein er bemærkelsesværdigt sammenlignet med andre lignende systemer med samme mellemrum. For eksempel bemærker vi, at et typisk 1-nm-langt peptid vil passere liter 12 nA ved 0,5 V (19), svarende til det, der passeres af en enkelt 1,2 nm-lang oktandithiol (20). Alle andre faktorer er ens og antager et eksponentielt fald i (tunnel) strøm med stigende molekylelængde, giver en strøm på liter 10-23 A for et liter 35-nm2 område (svarende til arealet af en bR trimer plus lipider) ved hjælp af Simmons-modellen til direkte tunneling (sammenlign afsnit 2 og figur 2 i ref. 21). Baseret på vores optiske absorptionsdata estimerer vi tætheden af bR i vores membraner til at være 109 bR trimer pr.0,002-cm2 kryds. Denne værdi omsættes til en eksperimentelt målt strøm på 3 liter 10-19 a PR bR trimer, dvs., mindst fire størrelsesordener mere end hvad der estimeres til direkte tunneling gennem 5-nm peptider, alkyler eller et dielektrisk medium med lignende Dielektrisk konstant. Det er derfor sandsynligt, at processen med nuværende transport er mere kompleks end simpel tunneling gennem en enkelt barriere. Faktisk er naturlige proteiner, hvis funktion involverer elektronoverførsel, ofte nødt til at overføre elektroner med høj retningsspecificitet over store afstande. En sådan overførsel over længere afstande involverer altid en kæde af cofaktorer, f.eks. I analogi med disse redokscentre kan vi overveje retinal, det kurstelektronsystem, der er i midten af bR, som et mellemprodukt på elektronernes vej gennem proteinet. Hvis processen i stedet for tunneling gennem et langt molekyle forekommer i (mindst) to trin med en delokaliseret elektronvejsstation 2,3 nm fra hver side, estimater svarende til dem, der er anvendt ovenfor, giver strømme på 10-20 a PR 35 nm2 (21) .

for at kontrollere denne sidste ide eksperimentelt forberedte og undersøgte vi kryds af retinalfrie bR-membraner. For at forberede disse membraner belyste vi først proteinet blandet med hydroksylamin. Denne reaktion fører til at bryde den protonerede Schiff-basisbinding, hvilket giver apo-proteinbakterioopsin (BO) og retinaloksim, som forbliver bundet til membranen (12). Retinaloksim blev derefter fjernet ved resuspendering af apo-membranerne i en opløsning af BSA efterfulgt af inkubation og centrifugering. BSA opløser kompetitivt det retinaloksimum, der er indlejret i membranen. Gentagne centrifugevask fjerner BSA, når proteinet er renset for alle chromophore-forurenende stoffer (5). Strømstrømmen gennem den (nethindefri) apo-membran er cirka tre størrelsesordener lavere end observeret med native bR-membraner (sammenlign Fig. 4 A og 3 A). Strømmen var meget støjende og ustabil. Dette resultat understøtter ideen om, at strømmen flyder dominerende gennem bR-proteinerne, og at nethinden fungerer som en nuværende transportmediator. Desuden kan den fotoeffekt, der observeres med de native bR-holdige membraner, tilskrives nethinden.

Fig. 4.

I–V egenskaber ved metal–apo-membran–metalforbindelser. A) typisk i-V karakteristisk for et au/apo-membran (nethindefri) / (APTMS-Aloks–Al) kryds fremstillet ved vesikelfusion og målt ved omgivende forhold. (B) I-V-kurver af Au/apo–membran(apo–protein bR plus retinaloksim)/(APTMS-Aloks-Al) knudepunkt fremstillet ved vesikelfusion og målt ved omgivende forhold i mørke og ved belysning ved Karr > 550 nm. Der blev ikke observeret nogen fotoeffekt på forbindelsesstrømmen.

for at kontrollere, om retinal–protein-kovalent binding er en forudsætning for elektrontransport, målte vi apo-membranprøver indeholdende retinaloksim. I det mindste en del af retinaloksim vil stadig besætte retinalbindingsstedet som udledt af CD-spektroskopi (23). I-V-kurver af sådanne prøver viste adfærd svarende til native bR med hensyn til nuværende størrelse, men de viste ikke noget svar på grønt lys som forventet i prøver, der manglede absorption i denne region (Fig. 4 B). I-V-egenskaberne er tættere på lineære end hvad vi finder for vildtypeprøver, hvilket kan indikere en ændring af tunnelgabet mellem retinal og retinaloksim.

for at kaste yderligere lys over effekten af nethindeisomerisering og fotocyklussen på lyseffekten studerede vi kunstige pigmenter afledt af 13-cis (3)-låste retinaler (skema 1), hvor den kritiske C 13 indlejret billede1C 14 isomerisering er blokeret af en 5-ledet ringstruktur (24, 25). I-V-egenskaber svarende til dem, der opnås med apo-membraner med nethindeoksyme, findes for disse kunstige pigmenter. Manglen på fotoeffekt i kryds lavet med apo-membraner er i overensstemmelse med fraværet af en fotocyklus i disse prøver (24, 26), hvilket understøtter hypotesen om, at forekomst af nethindeisomerisering er en forudsætning for lyseffekten. Vi antager, at der ikke forekommer nogen udtalt, elektrisk feltinduceret, bR-konformationsændring (dvs.bR vil forblive native-lignende) i felterne 10 6 V/cm på tværs af proteinet, der nås i vores eksperimenter. Vi bemærker, at Au topelektroden er semitransparent til grønt lys. For eksempel transmitterer en 55-nm Au-film 70% ved 550 nm (27). En mulig fysisk Oprindelse af fotoeffekten fra selve nanogap, plan, metal nanostruktur, for eksempel ved overfladeplasmon-ophidselse, kan sikkert udelukkes (28). På baggrund af disse og de ovenfor beskrevne resultater tilskriver vi fotoeffekten på forbindelsesstrømmene til 13-cis/all-trans retinal fotoisomerisering (4) og de proteinkonformationsændringer, der er resultatet af det. Vi bemærker, at elektronerne i vores eksperimenter stammer fra metalelektroder og passerer gennem bR fra elektrode til elektrode under påført spænding, hvor bR fungerer som et elektronisk ledningsmedium. I denne henseende adskiller bR sig fra systemer som de fotosyntetiske reaktionscentre, hvor elektronoverførsel mellem cofaktorer er fotoinduceret.

det fremgår af beregningerne og fra for eksempel det negative resultat af Fig. 4 A, at mekanismen ikke er (kun) en af direkte tunneling. Det er også usandsynligt, at det (udelukkende) er en af hopping i betragtning af (enkeltmolekylet) resultaterne af Selsers arbejde et al. (29). Hvordan kan elektronerne krydse proteinet? Vores eksperimentelle resultater indikerer tydeligt, at nethindekromoforen er en nødvendig komponent til ledningsprocessen. Det er velkendt, at nethinden er forbundet til den ekstracellulære side via et H-bundet netværk, som sandsynligvis tilvejebringer en elektrostatisk screenet sti til ladningstransport. Fordi der også er god kobling mellem retinal og ekstracellulær side i mørket, skal denne sti være til stede uanset belysning. Dens tilstedeværelse kan forklare de højere end forventede strømme, som vi måler. Forbindelsen af nethinden til den cytoplasmatiske overflade er kendt for at være lysaktiveret, hvilket kan forklare den lyseffekt, vi observerer. Begge disse forslag har brug for yderligere undersøgelse.

betydningen af ladningsoverførsel mellem nethindekromoforen og proteinmiljøet for bR i dets grundtilstand blev foreslået, baseret på teori, af Sakai et al. (30). Disse forfattere antog, at kromoforen stabiliseres i bR ved en interaktion mellem dens højest besatte og laveste ubesatte molekylære orbitaler med proteinmiljøet. Hvis der overføres tilstrækkelig ladning mellem to steder på grund af den stærke højest besatte–laveste ubesatte molekylære orbitalinteraktion, kan den (kur-konjugerede) kromofor ses som en en-elektron-reduceret/-iltet art (hvis den opfører sig som en elektronacceptor/donor). Den mest sandsynlige chromophore-protein-interaktion blev beregnet til at være via det H-bundne netværk langs den formodede protonvej.

det er også fristende at antyde, at protonkoblet elektrontransport (22, 31) spiller en rolle, fordi der er kvasi-endimensionelle protonerede vandkæder i protonkanalen i bR (32, 33) indlejret i faste understøttede lipid-dobbeltlag, hvilket vil være normalt for de to elektroder i vores opsætning (17). Dette forslag kan forklare en del af forskellen mellem elektrontransport gennem bR og gennem angiveligt vandfrie peptider. I lyset af en sådan situation opstår der flere spørgsmål.

  1. hvor meget, hvis overhovedet, kan elektrontransport gennem bR drage fordel af en indbygget protonkanal?

  2. hvordan vil kromoforen og den mellemliggende proteinstruktur påvirke hastigheden af langtrækkende elektrontransport?

  3. i hvilket omfang kan bundne vandmolekyler inde i bR bidrage til den elektroniske strøm?

muligvis kan temperaturafhængige i-V–målinger, selvom disse langt fra er trivielle med dette system, kaste lys over disse problemer.

Vi bemærker, at I modsætning til tilfældet med et bR-monolag i opløsning er den Faradaiske fotostrøm af et tørt bR-monolag, der stammer fra transmembran protontranslokation, ubetydelig sammenlignet med de observerede forbindelsesstrømme, fordi protonkilden er begrænset. Vores konstatering af, at alle observerede krydsstrømme (i mørkt eller under grønt lys) er nul inden for eksperimentel fejl, understøtter fraværet af stabil protontranslokation. Der er derfor ingen målbar fotoresponse mellem ca. 30 mV. ref. 34; enhver 15 – til 20-mV-fotovoltage er i støj fra vores måling), hvilket indikerer, at lysdrevet protontranslokation over bR-monolaget, der holdes mellem elektroderne, bidrager ubetydeligt til steady-state lysstrømme. Denne konklusion blev bekræftet af de proton-translokationsinducerede bR-fotostrømme i lignende solid-understøttede lipid–dobbeltlag (typisk 4-8 nA/cm2) (18), der er to til tre størrelsesordener lavere end de krydsstrømme, som vi måler her (pri 0,5-5 prita/cm2). Selv uden nogen direkte forbindelse mellem proton-og elektrontransport bemærker vi stadig, at et protein, der fra elektrostatikpunktet (screening) er egnet til protonoverførsel, muligvis kan bruge den samme screeningsmekanisme for at lette elektrontransport.

Vi kan også sammenligne vores resultater med de tidligere rapporterede fotostrømme gennem de tørre multilag på 500 nm (8) og 100-liter (9) tørlag ved at beregne værdier pr.PM monolag (5 nm). En sådan normalisering giver værdier på 0,01 kr. nA pr. enkelt PM-lag pr. cm2, dvs., omkring fire til fem størrelsesordener mindre end de krydsstrømme, som vi måler her (kr.0,5–5 kr./cm2). Denne dramatiske forskel illustrerer vanskeligheden ved at fortolke de tidligere banebrydende målinger (9) og understreger vigtigheden af at bruge så veldefineret en konfiguration som muligt til elektrontransportmålinger af biologiske systemer. Med sådanne konfigurationer bliver det så også muligt at foretage målinger som en funktion af kontrollerede variationer af systemet.

resultater og diskussion en suspension af PM-fragmenter indeholdende vildtype bR blev fremstillet (12) og rekonstitueret med eksogent ægphosphatidylcholin (PC) til vesikler ved en modifikation af Racermetoden (13). For yderligere at kontrollere proteinmængdeafhængige strømspændingsegenskaber (i–V) blev en anden vesikulær bR–suspension fremstillet ved anvendelse af octylthioglucosid (OTG) som vaskemiddel (14). Monolag af de native br-holdige membraner blev…

resultater og diskussion en suspension af PM-fragmenter indeholdende vildtype bR blev fremstillet (12) og rekonstitueret med eksogent ægphosphatidylcholin (PC) til vesikler ved en modifikation af Racermetoden (13). For yderligere at kontrollere proteinmængdeafhængige strømspændingsegenskaber (i–V) blev en anden vesikulær bR–suspension fremstillet ved anvendelse af octylthioglucosid (OTG) som vaskemiddel (14). Monolag af de native br-holdige membraner blev…

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.