Bacteriorodopsina (bR) como medio de conducción electrónica: Transporte de corriente a través de monocapas que contienen bR

Resultados y Discusión

Se preparó una suspensión de fragmentos de PM que contenían bR de tipo salvaje (12) y se reconstituyó con fosfatidilcolina de huevo exógena (PC) en vesículas mediante una modificación del método de Racker (13). Para verificar más a fondo las características de voltaje de corriente dependiente de la cantidad de proteínas (I-V), se preparó otra suspensión vesicular bR utilizando octiltioglucósido (OTG) como detergente (14). Las monocapas de las membranas nativas que contienen bR se prepararon adsorbiendo las vesículas en un sustrato de Al (una película de Al de espesor ≈50 nm evaporada en cuarzo) con una capa de óxido de aluminio natural en su superficie (representada aquí como AlOx). Las vesículas unidas se abren y se fusionan, formando bicapas lipídicas sólidas. Para promover la adsorción electrostática de las vesículas, primero silanizamos la superficie del sustrato con (3-aminopropil)trimetoxisilano (APTMS) (15), seguido de un tratamiento con HCl de 0,1 M, para obtener una superficie con carga positiva. Tanto las suspensiones de vesículas bR/PC como bR/OTG mostraron bombeo de protones hacia adentro inducido por la luz, como se encontró anteriormente (13, 16). Con base en esta observación, postulamos una orientación preferencial del bR con el lado citoplasmático orientado hacia la superficie del sustrato después de la fusión de vesículas para formar membranas monocapa de bR, consistente con la translocación de protones transmembrana dependiente de la orientación (17).

Fig. 2 A muestra una imagen representativa de AFM de un sustrato, cubierto por membranas de vesículas fusionadas que contienen bR, preparadas por adsorción de 10 minutos en el sustrato. Debido a que es difícil obtener una monocapa ideal (cobertura del 100%), siempre hay algunas grietas o agujeros sin muestras (típicamente decenas de nanómetros) entre las membranas de las vesículas fusionadas. Estas grietas y agujeros son lo suficientemente pequeños como para que la almohadilla Au (0,5 mm de diámetro) los cubra (para la medición del transporte), pero lo suficientemente grandes como para que nuestras mediciones de AFM hagan posibles las mediciones de espesor. El análisis de secciones muestra que la característica de altura media más alta es ≈5,2 nm, lo que concuerda bien con el grosor de un único parche de PM, lo que indica la formación de una monocapa bR. Los pocos puntos blancos de la Fig. 2 A son vesículas aplanadas sobrantes en la parte superior de la película. Membranas que contienen monocapa BR más densas (Fig. 2 B) resultado después de ≈20 minutos de adsorción de las vesículas en el sustrato. Higo. 2 B también permite una medición fortuita del espesor de la membrana/monocapa (5,1 nm entre marcadores) debido a una grieta en la membrana como resultado de un secado excesivo. Tiempos de adsorción más largos (>30 min) llevaron a la formación de múltiples capas. Las monocapas de membranas con bR modificado se prepararon utilizando los mismos procedimientos. Todas las muestras para mediciones de transporte eléctrico se prepararon en 20 minutos de adsorción y se verificaron por AFM para asegurar la calidad de la monocapa. Vale la pena mencionar que, a diferencia de las bicapas lipídicas puras soportadas en la superficie, que son inestables y se desintegrarán al secarse (y mucho menos al secarse bajo flujo de N2) debido a la pérdida de interacciones hidrofóbicas entre los lípidos en estado seco, las membranas PC/bR preparadas son bastante estables (incluso después de un secado suave de N2), como revelan las imágenes de AFM. Atribuimos este fenómeno a las altas cargas negativas en las superficies bR, que pueden interactuar fuertemente con la superficie del sustrato con carga positiva y actuar como un andamio para endurecer las bicapas lipídicas. Esta interacción hace que las bicapas sean lo suficientemente robustas para permitir estudios de transporte de electrones repetidos y reproducibles en forma de monocapa en condiciones ambientales y a temperatura ambiente.

Fig. 2. Imágenes de MFA de membranas fusionadas que contienen bR . (A Izquierda) Imágenes representativas de AFM (2 × 2 µm) de monocapas de membranas fusionadas de vesículas que contienen bR, preparadas mediante adsorción de 10 minutos en sustrato de Al/AlOx, derivadas con APTMS. Escaneos de línea (A Derecha y B Derecha) que muestran una altura media de las características más fuertes de ≈5,2 nm. La barra de altura cubre 20 nm. (B Izquierda) Un bR más denso que contiene una monocapa, preparado mediante adsorción de 20 minutos de vesículas en el sustrato (imagen de 1,25 × 1,25 µm). La grieta en la membrana, inducida por un secado excesivo (algo que se evitó cuidadosamente en la preparación de las muestras utilizadas para mediciones de transporte eléctrico) muestra que la monocapa tiene un grosor de 5,1 nm (entre marcadores).

Las mediciones I–V se llevaron a cabo en estructuras de unión planares en una sala limpia clase 10000 a 293K y 40% de humedad relativa, con la muestra intercalada entre el sustrato Al/AlOx y los contactos Au. En cada muestra, se depositaron varias almohadillas de Au pequeñas de 0,5 mm de diámetro en la monocapa mediante la técnica LOFO. El circuito se completa colocando suavemente un electrodo de tungsteno en el electrodo de oro (11). La principal ventaja de utilizar la técnica de LOFO para preparar el contacto superior, en comparación con la deposición por evaporación de metal o los contactos de mercurio, es que los parches metálicos preformados pueden flotar y atravesar algunos pequeños agujeros y grietas (típicamente en decenas de nanómetros), lo que hace que las mediciones eléctricas sean exitosas. Higo. 3 A muestra las características típicas de I-V de una unión metal/(monocapa BR en bicapa lipídica)/metal resultante en un rango de sesgo de ±1 V. Las curvas I–V se registraron después de un equilibrio oscuro seguido de irradiación con luz verde (λ > 550 nm, 20 mW/cm2). En la oscuridad, se detectaron flujos de 0,75 nA con un sesgo aplicado de 1 V. Después de la iluminación en estado estacionario con luz verde, la corriente aumenta de 0,75 a 1,7 nA con un sesgo aplicado de 1 V. Una vez bloqueada la luz verde, la corriente decayó durante 2-3 minutos a su valor oscuro original. Posiblemente, el efecto de la luz está asociado con la formación del intermediario M inducido fotoquímicamente que bien puede tener un decaimiento térmico más lento en condiciones de monocapa seca que en membranas en solución (18). El sistema puede ser cíclico entre estos dos estados alternando la adaptación a la luz verde y a la oscuridad, lo que indica que la preparación bR conserva su fotoactividad. Los dispositivos de control con solo una monocapa APTMS incorporada entre los contactos Al/AlOx y Au siempre estaban en cortocircuito con resistencias de unión típicas <50 Ω, lo que indica que las capas Alo x son lo suficientemente delgadas para mediciones eléctricas confiables.

Fig. 3. características

I-V de las uniones metálicas (monocapa bR). A) Curvas I–V de una unión Au/(BR salvaje)/(APTMS-AlOx–Al) que contiene una monocapa bR orientada, preparada por fusión de vesículas y medida en condiciones ambientales en la oscuridad, tras la iluminación a λ > 550 nm, y adaptación a la oscuridad. Las flechas muestran que las respuestas I–V pueden ser cicladas entre los dos estados. El área de la almohadilla Au era de 2,10 a 3 cm2. B) Gráfico de corrientes oscuras a una tensión de polarización de +1,0 V para ocho uniones independientes preparadas a partir de vesículas bR/PC y de vesículas bR/OTG, respectivamente.

El papel crucial que juega el bR en la producción de las corrientes de transmembrana medidas se ilustra mediante el uso de otra membrana monocapa con mayor contenido de bR, que se preparó como se informó en ref. 14 mediante el uso de OTG como detergente para la formación de vesículas bR. Estos dos tipos de monocapa bR (que contienen membranas con diferentes contenidos de bR preparadas a partir de vesículas bR/PC o bR/OTG) se señalarán como membrana A o B y unión A o B para uniones correspondientes. Las absorbancias típicas (en DO) a ≈560 nm son ≈0,15 × 10-3 y ≈1,0 × 10-3 para la membrana A y B, respectivamente. El contenido de bR de la membrana B (≈6 veces más alto que el de la membrana A) es similar al de bR en una monocapa de PM seca, basado tanto en la absorbancia experimental (18) como en el valor, calculado para una monocapa de PM ideal (≈1 × 10-3 DO a ≈560 nm). Las corrientes oscuras promediadas en un sesgo aplicado dado de las uniones B son casi ocho veces las encontradas con las uniones A, es decir, muy proporcionales al contenido de bR en las membranas (Fig. 3 B). Este hallazgo sugiere que los electrones pasan principalmente a través de bR a través de la membrana en lugar de a través de las bicapas lipídicas. Ambas uniones A y B son fotoactivas y, cuando se normalizan al contenido de bR, muestran características I–V similares.

Los efectos de luz promedio en el flujo de corriente de las uniones A y B son típicamente ≈1 y ≈3 nA con un sesgo aplicado de 1 V, respectivamente. El cambio inducido por la luz en la corriente de unión B es algo menor de lo esperado, basado en el contenido de bR de los dos tipos de muestras. La diferencia puede deberse a diferencias en las fracciones del intermedio M que pueden acumularse en las muestras A y B y/o a diferencias entre las dos muestras en el cambio de conformación de proteínas fotoinducido, impuesto por la formación de M.

El flujo de corriente medible a través de la proteína de 5 nm de espesor es notable, en comparación con otros sistemas similares con la misma brecha. Por ejemplo, observamos que un péptido típico de 1 nm de largo pasará ≈12 nA a 0,5 V (19), similar al pasado por un solo ditiol de octano de 1,2 nm de largo (20). Todos los demás factores siendo iguales y suponiendo una disminución exponencial en la corriente (de túnel) con el aumento de la longitud de la molécula, produce una corriente de ≈10-23 A para un área ≈35-nm2 (equivalente al área de un BR trimer más lípidos), utilizando el modelo de Simmons para túnel directo (compare la sección 2 y la figura 2 en ref. 21). En base a nuestros datos de absorción óptica, estimamos que la densidad de bR en nuestras membranas es ≈109 BR trimer por unión de 0,002-cm2. Este valor se traduce en una corriente medida experimentalmente de 3 × 10-19 A por BR trimer, i. e., al menos cuatro órdenes de magnitud más de lo que se estima para la tunelización directa a través de péptidos de 5 nm, alquilos o un medio dieléctrico con constante dieléctrica similar. Por lo tanto, es probable que el proceso de transporte de corriente sea más complejo que el simple túnel a través de una sola barrera. De hecho, las proteínas naturales cuya función implica la transferencia de electrones a menudo necesitan transferir electrones con alta especificidad direccional a grandes distancias. Dicha transferencia a distancias más largas siempre involucra una cadena de cofactores, como los centros redox (22). En analogía con estos centros redox, podemos considerar retinal, el sistema de electrones π que se encuentra en el centro de bR, como un intermediario en el camino de los electrones a través de la proteína. Si, en lugar de hacer un túnel a través de una molécula larga, el proceso ocurre en (al menos) dos pasos, con una estación de paso de electrones deslocalizada a 2,3 nm de cada lado, las estimaciones similares a las utilizadas anteriormente dan corrientes de ≈10-20 A por 35 nm2 (21) .

Para comprobar experimentalmente esta última idea, preparamos y examinamos uniones de membranas bR sin retina. Para preparar estas membranas, primero iluminamos la proteína mezclada con hidroxilamina. Esta reacción conduce a romper el enlace protonado de la base de Schiff, produciendo la apoproteína bacterioopsina (BO) y la retinaloxima, que permanece unida a la membrana (12). La retinaloxima se eliminó resuspendiendo las apomembranas en una solución de ASC, seguida de incubación y centrifugación. BSA solubiliza competitivamente la retinaloxima que está incrustada dentro de la membrana. Los lavados repetidos por centrifugación eliminan el BSA una vez que la proteína se ha purificado de todos los contaminantes cromóforos (5). El flujo de corriente a través de la apomembrana (libre de retina) es aproximadamente tres órdenes de magnitud menor que el observado con membranas bR nativas (compare las Figs. 4 A y 3 A). La corriente era muy ruidosa e inestable. Este resultado apoya la idea de que la corriente fluye predominantemente a través de las proteínas bR y que la retina sirve como mediador de transporte actual. Además, el efecto fotográfico observado con las membranas nativas que contienen bR se puede atribuir a la retina.

Fig. 4. características

I – V de las uniones metal-apomembrana-metal. A) Característica típica I–V de una unión Ua/apomembrana (sin retina)/(APTMS-AlOx-Al) preparada por fusión de vesículas y medida en condiciones ambientales. B) Curvas I–V de la unión Au/apomembrana (apoproteína bR más retinaloxima)/(APTMS-AlOx-Al) preparadas por fusión de vesículas y medidas en condiciones ambientales en la oscuridad y con iluminación a λ > 550 nm. No se observó fotoefecto en la corriente de unión.

Para verificar si el enlace covalente de la proteína retiniana es un requisito previo para el transporte de electrones, medimos muestras de apomembrana que contenían retinaloxima. Al menos una parte de la retinaloxima seguirá ocupando el sitio de unión de la retina, como se deduce de la espectroscopia de EC (23). Las curvas I-V de dichas muestras mostraron un comportamiento similar al de bR nativo en términos de magnitud actual, pero no mostraron ninguna respuesta a la luz verde como se esperaba en muestras que carecen de absorción en esta región (Fig. 4 B). Las características I–V son más lineales que las que encontramos para muestras de tipo salvaje, lo que puede indicar un cambio en el espacio de túnel entre la retina y la retinaloxima.

Para arrojar más luz sobre el efecto de la isomerización retiniana y el fotociclo sobre el efecto de la luz, estudiamos pigmentos artificiales derivados de retinales bloqueados con 13 cis (3) (Esquema 1), donde la isomerización crítica C 13 Imagen incrustada1C 14 está bloqueada por una estructura de anillo de 5 miembros (24, 25). Las características I–V similares a las obtenidas con apomembranas con oxima retiniana se encuentran para esos pigmentos artificiales. La falta de fotoefecto en las uniones hechas con apomembranas está en consonancia con la ausencia de un fotociclo en estas muestras (24, 26), apoyando la hipótesis de que la ocurrencia de isomerización retiniana es un requisito previo para el efecto de luz. Suponemos que no se produce ningún cambio conformacional pronunciado, inducido por el campo eléctrico (es decir, el bR permanecerá como nativo) en los campos ≤10 6 V/cm a través de la proteína que se alcanzan en nuestros experimentos. Observamos que el electrodo superior Au es semitransparente para la luz verde. Por ejemplo, una película Au de 55 nm transmite ≈70% a ≈550 nm (27). Se puede descartar con seguridad un posible origen físico del fotoefecto a partir de la nanoestructura metálica plana de nanogap, por ejemplo, mediante excitación de plasmón superficial (28). Sobre la base de estos y los resultados descritos anteriormente, atribuimos el fotoefecto en las corrientes de unión a la fotoisomerización retiniana 13-cis/all-trans (4) y los cambios conformacionales de proteínas que resultan de ella. Observamos que en nuestros experimentos los electrones se originan a partir de electrodos metálicos y pasan a través de bR de electrodo a electrodo bajo voltaje aplicado, con bR actuando como un medio de conducción electrónica. En este sentido, bR difiere de sistemas como los centros de reacción fotosintéticos, en los que la transferencia de electrones entre cofactores es fotoinducida.

Se desprende claramente de los cálculos y, por ejemplo, del resultado negativo de la Fig. 4 A que el mecanismo no es (solo) uno de túnel directo. También es poco probable que sea (únicamente) uno de salto en vista de los resultados (de una sola molécula) del trabajo de Selzer et al. (29). Entonces, ¿cómo pueden los electrones cruzar la proteína? Nuestros resultados experimentales indican claramente que el cromóforo de la retina es un componente necesario para el proceso de conducción. Es bien sabido que la retina está conectada al lado extracelular a través de una red unida en H, que probablemente proporciona una ruta de detección electrostática para el transporte de carga. Debido a que también hay un buen acoplamiento entre el lado retiniano y extracelular en la oscuridad, este camino debe estar presente independientemente de la iluminación. Su presencia puede explicar las corrientes más altas de lo esperado que medimos. Se sabe que la conexión de la retina a la superficie citoplasmática está activada por la luz, lo que puede explicar el efecto de la luz que observamos. Ambas sugerencias necesitan más investigación.

La importancia de la transferencia de carga entre el cromóforo retiniano y el entorno proteico para el bR en su estado fundamental fue sugerida, con base en teoría, por Sakai et al. (30). Estos autores plantearon la hipótesis de que el cromóforo se estabiliza en bR por una interacción de sus orbitales moleculares ocupados más altos y desocupados más bajos con el entorno proteico. Si se transfiere carga suficiente entre dos sitios, debido a la fuerte interacción orbital molecular ocupado–bajo no ocupado, el cromóforo (conjugado π) se puede ver como una especie oxidada/reducida a un electrón (si se comporta como un receptor/donante de electrones). La interacción cromóforo–proteína más probable se calculó a través de la red enlazada en H a lo largo de la presunta vía de protones.

También es tentador sugerir que el transporte de electrones acoplados a protones (22, 31) juega un papel porque hay cadenas de agua protonadas cuasi unidimensionales en el canal de protones de bR (32, 33) incrustadas en bicapas lipídicas sólidas, que serán normales para los dos electrodos de nuestra configuración (17). Esta sugerencia puede explicar parte de la diferencia entre el transporte de electrones a través de bR y a través de péptidos supuestamente libres de agua. En vista de esta situación, se plantean varias cuestiones.

  1. ¿En qué medida, si es que se puede beneficiar el transporte de electrones a través de bR de un canal de protones incorporado?

  2. ¿Cómo afectarán el cromóforo y la estructura proteica intermedia a la velocidad de transporte de electrones de largo alcance?

  3. ¿En qué medida las moléculas de agua unidas dentro de bR pueden contribuir a la corriente electrónica?

Posiblemente, las mediciones I – V dependientes de la temperatura, aunque están lejos de ser triviales con este sistema, pueden arrojar luz sobre estos problemas.

Observamos que, a diferencia del caso de una monocapa de bR en solución, la fotocorriente faradaica de una monocapa de bR seca que se origina a partir de la translocación de protones transmembrana es insignificante en comparación con las corrientes de unión observadas porque la fuente de protones es limitada. Nuestro hallazgo de que todas las corrientes de unión observadas (en la oscuridad o bajo luz verde) son cero, dentro de un error experimental , apoya la ausencia de translocación de protones en estado estacionario. Por lo tanto, no hay fotorespuesta medible entre aproximadamente ±30 mV a ≈0 V (cf. ref. 34; cualquier fotovoltaica ≤ 15 a 20 mV está en el ruido de nuestra medición), lo que indica que la translocación de protones impulsada por la luz a través de la monocapa bR mantenida entre los electrodos contribuye de manera insignificante a las corrientes de luz de estado estacionario. Esta conclusión fue confirmada por las fotocorrientes bR inducidas por la translocación de protones en bicapas lipídicas sólidas similares (típicamente 4-8 nA / cm2) (18) que son de dos a tres órdenes de magnitud más bajas que las corrientes de unión que medimos aquí (≈0,5–5 µA/cm2). Aun así, incluso sin ninguna conexión directa entre el transporte de protones y electrones, observamos que una proteína que, desde el punto de vista de la electrostática (cribado), es adecuada para la transferencia de protones, bien puede ser capaz de utilizar el mismo mecanismo de cribado para facilitar el transporte de electrones.

También podemos comparar nuestros resultados con las fotocorrientes reportadas previamente a través de las multicapas secas ≈500 nm (8) y ≈100 µm (9) calculando valores por monocapa PM (5 nm). Dicha normalización produce valores de ≈0,01 nA por capa de partículas individuales por cm2, p. ej., unos cuatro o cinco órdenes de magnitud menos que las corrientes de unión que medimos aquí (≈0,5-5 µA / cm2). Esta diferencia dramática ilustra la dificultad de interpretar las mediciones pioneras anteriores (9) y subraya la importancia de utilizar una configuración lo más definida posible para las mediciones de transporte de electrones de sistemas biológicos. Con tales configuraciones, también es posible realizar mediciones en función de variaciones controladas del sistema.

Resultados y Discusión Se preparó una suspensión de fragmentos de PM que contenían bR de tipo salvaje (12) y se reconstituyó con fosfatidilcolina de huevo exógena (PC) en vesículas mediante una modificación del método de Racker (13). Para verificar más a fondo las características de voltaje de corriente dependiente de la cantidad de proteínas (I-V),…

Resultados y Discusión Se preparó una suspensión de fragmentos de PM que contenían bR de tipo salvaje (12) y se reconstituyó con fosfatidilcolina de huevo exógena (PC) en vesículas mediante una modificación del método de Racker (13). Para verificar más a fondo las características de voltaje de corriente dependiente de la cantidad de proteínas (I-V),…

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