La bactériorhodopsine (bR) comme milieu de conduction électronique : Transport de courant à travers des monocouches contenant du bR

Résultats et discussion

Une suspension de fragments de PM contenant du bR sauvage a été préparée (12) et reconstituée avec de la phosphatidylcholine d’œuf exogène (PC) en vésicules par une modification de la méthode de Racker (13). Pour vérifier davantage les caractéristiques courant-tension (I-V) dépendantes de la quantité de protéines, une autre suspension vésiculaire de bR a été préparée en utilisant l’octylthioglucoside (OTG) comme détergent (14). Des monocouches des membranes natives contenant du bR ont ensuite été préparées en adsorbant les vésicules sur un substrat d’Al (un film d’Al évaporé sur quartz d’une épaisseur de ≈50 nm) avec une couche d’oxyde d’aluminium naturel à sa surface (représentée ici en AlOx). Les vésicules attachées s’ouvrent et fusionnent, formant des bicouches lipidiques solides. Pour favoriser l’adsorption électrostatique des vésicules, nous avons d’abord silanisé la surface du substrat avec du (3-aminopropyl) triméthoxysilane (APTMS) (15), suivi d’un traitement avec du HCl 0,1 M, pour obtenir une surface chargée positivement. Les suspensions de vésicules bR/PC ou bR/OTG ont montré un pompage de protons vers l’intérieur induit par la lumière, comme cela a été constaté précédemment (13, 16). Sur la base de cette observation, nous postulons une orientation préférentielle de bR avec le côté cytoplasmique faisant face à la surface du substrat après la fusion des vésicules pour former des membranes monocouches de bR, compatible avec la translocation transmembranaire de protons dépendante de l’orientation (17).

Fig. 2a représente une image AFM représentative d’un substrat, recouvert de membranes vésiculaires fusionnées contenant du bR, préparée par adsorption 10 min sur le substrat. Parce qu’il est difficile d’obtenir une monocouche idéale (couverture à 100%), il y a toujours des fissures ou des trous d’épingle sans échantillon (généralement des dizaines de nanomètres) entre les membranes vésiculaires fusionnées. Ces fissures et trous d’épingle sont suffisamment petits pour que le tampon Au (diamètre de 0,5 mm) puisse les combler (pour la mesure de transport) mais suffisamment grands pour que nos mesures AFM permettent des mesures d’épaisseur. L’analyse en coupe montre que la caractéristique de hauteur moyenne la plus élevée est ≈5,2 nm, ce qui correspond bien à l’épaisseur d’une seule tache de particules, ce qui indique la formation d’une monocouche de bR. Les quelques points blancs de la Fig. 2 A sont des vésicules aplaties restantes sur le dessus du film. Membranes monocouches bR plus denses (Fig. 2 B) résultat après adsorption ≈20 min des vésicules sur le substrat. Figue. 2b permet également une mesure fortuite de l’épaisseur membrane/monocouche (5,1 nm entre les marqueurs) en raison d’une fissure dans la membrane résultant d’un séchage excessif. Des temps d’adsorption plus longs (> 30 min) ont conduit à la formation de couches multicouches. Des monocouches de membranes avec du bR modifié ont été préparées en utilisant les mêmes procédures. Tous les échantillons pour les mesures de transport électrique ont été préparés par 20 min d’adsorption et contrôlés par AFM pour assurer la qualité de la monocouche. Il convient de mentionner que, contrairement aux bicouches lipidiques pures supportées en surface, qui sont instables et se désintègrent au séchage (sans parler du séchage sous flux de N2) en raison de la perte d’interactions hydrophobes entre lipides à l’état sec, les membranes PC/ bR préparées telles quelles sont plutôt stables (même après un séchage doux au N2), comme le révèlent les images AFM. Nous attribuons ce phénomène aux charges négatives élevées sur les surfaces de bR, qui peuvent interagir fortement avec la surface du substrat chargée positivement et agir comme un échafaudage pour rigidifier les bicouches lipidiques. Cette interaction rend les bicouches suffisamment robustes pour permettre des études de transport d’électrons répétées et reproductibles en monocouche dans des conditions ambiantes et à température ambiante.

Fig. 2.

Images AFM de membranes fusionnées contenant du bR. (A gauche) Des images AFM représentatives (2 × 2 µm) de monocouches de membranes fusionnées de vésicules contenant du bR, préparées par adsorption 10 min sur substrat Al/AlOx, dérivatisées avec des APTMS. (A à droite et B à droite) Balayages de ligne montrant une hauteur moyenne des caractéristiques les plus fortes de ≈5,2 nm. La barre de hauteur couvre 20 nm. (B à gauche) Un bR plus dense contenant une monocouche, préparé par adsorption 20 min de vésicules sur le substrat (image 1,25 ×1,25 µm). La fissure dans la membrane, induite par un séchage excessif (ce qui a été soigneusement évité lors de la préparation des échantillons utilisés pour les mesures de transport électrique) montre que la monocouche a une épaisseur de 5,1 nm (entre les marqueurs).

Des mesures I–V ont été effectuées sur des structures de jonction planes dans une salle blanche de classe 10000 à 293K et 40% d’humidité relative, l’échantillon étant pris en sandwich entre le substrat Al/AlOx et les contacts Au. Sur chaque échantillon, plusieurs petits tampons Au de 0,5 mm de diamètre ont été déposés sur la monocouche par la technique LOFO. Le circuit est complété en plaçant doucement une électrode de tungstène sur l’électrode d’or (11). Le principal avantage de l’utilisation de la technique LOFO pour préparer le contact supérieur, par rapport au dépôt par évaporation de métal ou aux contacts au mercure, est que les plaques métalliques préformées peuvent flotter et s’étendre sur de petits trous d’épingle et fissures (généralement en dizaines de nanomètres), ce qui permet de réussir les mesures électriques. Figue. 3 A montre les caractéristiques I–V typiques d’une jonction métal/ (bicouche monocouche bR dans la bicouche lipidique)/métal résultante sur une plage de polarisation de ± 1 V. Les courbes I-V ont été enregistrées après équilibration sombre suivie d’une irradiation avec de la lumière verte (λ> 550 nm, 20 mW/cm2). Dans l’obscurité, des flux de 0,75 nA avec un biais appliqué de 1 V ont été détectés. Après un éclairage en régime permanent avec une lumière verte, le courant passe de 0,75 à 1,7 nA avec une polarisation appliquée de 1 V. Une fois la lumière verte bloquée, le courant s’est désintégré pendant 2 à 3 minutes jusqu’à sa valeur d’obscurité d’origine. Éventuellement, l’effet de lumière est associé à la formation de l’intermédiaire M induite photochimiquement qui pourrait bien avoir une désintégration thermique plus lente dans des conditions monocouches sèches que dans les membranes en solution (18). Le système peut être cyclé entre ces deux états en alternant une adaptation à la lumière verte et à l’obscurité, indiquant que la préparation bR conserve sa photoactivité. Les dispositifs de contrôle avec seulement une monocouche APTMS incorporée entre les contacts Al/AlOx et Au étaient toujours court-circuités avec des résistances de jonction typiques < 50 Ω, indiquant que les couches ALO x sont suffisamment minces pour des mesures électriques fiables.

Fig. 3.

Caractéristiques I–V des jonctions métal– (monocouche bR)–métal. (A) Courbes I–V d’une jonction Au/ (BR sauvage)/ (APTMS-AlOx–Al) contenant une monocouche bR orientée, préparée par fusion de vésicules et mesurée dans des conditions ambiantes dans l’obscurité, lors d’un éclairage à λ> 550 nm, et adaptation à l’obscurité. Les flèches montrent que les réponses I-V peuvent être cyclées entre les deux états. La surface du tapis Au était de 2,10 à 3 cm2. (B) Tracé des courants sombres à une tension de polarisation de + 1,0 V pour huit jonctions indépendantes préparées à partir de vésicules bR / PC et de vésicules bR / OTG, respectivement.

Le rôle crucial que joue le bR dans la production des courants transmembranaires mesurés est illustré en utilisant une autre membrane monocouche à teneur en bR plus élevée, qui a été préparée comme indiqué dans ref. 14 en utilisant OTG comme détergent pour la formation de vésicules bR. Ces deux types de monocouches de bR (contenant des membranes à différentes teneurs en bR préparées à partir de vésicules bR/PC ou bR/OTG) seront notées membrane A ou B et jonction A ou B pour les jonctions correspondantes. Les absorbances typiques (en DO) à ≈560 nm sont ≈0,15 ×10-3 et ≈1,0 ×10-3 pour la membrane A et B, respectivement. La teneur en bR de la membrane B (≈6 fois supérieure à celle de la membrane A) est similaire à celle du bR dans une monocouche de PARTICULES sèches, sur la base à la fois de l’absorbance expérimentale (18) et de la valeur, calculée pour une monocouche de particules idéale (≈1 ×10-3 OD à ≈560 nm). Les courants d’obscurité moyens pour une polarisation appliquée donnée des jonctions B sont près de huit fois supérieurs à ceux trouvés avec les jonctions A, c’est-à-dire très étroitement proportionnels à la teneur en bR dans les membranes (Fig. 3 B). Cette découverte suggère que les électrons passent principalement par bR à travers la membrane plutôt que par les bicouches lipidiques. Les jonctions A et B sont photoactives et, lorsqu’elles sont normalisées à la teneur en bR, présentent des caractéristiques I–V similaires.

Les effets lumineux moyens sur le flux de courant des jonctions A et B sont typiquement ≈1 et ≈3 nA à une polarisation appliquée de 1 V, respectivement. Le changement induit par la lumière du courant de jonction B est un peu plus faible que prévu, sur la base des teneurs en bR des deux types d’échantillons. La différence peut être due à des différences dans les fractions de l’intermédiaire M qui peuvent s’accumuler dans les échantillons A et B et / ou avec des différences entre les deux échantillons dans le changement de conformation protéique photo-induite, imposé par la formation de M.

Le flux de courant mesurable à travers la protéine de 5 nm d’épaisseur est remarquable, comparé à d’autres systèmes similaires avec le même écart. Par exemple, nous notons qu’un peptide typique de 1 nm de long passera ≈12 nA à 0,5 V (19), similaire à celui passé par un seul dithiol d’octane de 1,2 nm de long (20). Tous les autres facteurs étant égaux et supposant une diminution exponentielle du courant (tunnel) avec l’augmentation de la longueur de la molécule, donne un courant de ≈10-23 A pour une surface ≈35-nm2 (équivalent à la surface d’un trimère bR plus les lipides), en utilisant le modèle de Simmons pour le tunneling direct (comparer la section 2 et la figure 2 en réf. 21). Sur la base de nos données d’absorption optique, nous estimons la densité de bR dans nos membranes à ≈109 trimères bR par jonction de 0,002 cm2. Cette valeur se traduit par un courant mesuré expérimentalement de 3 × 10-19 A par trimère bR, i.e., au moins quatre ordres de grandeur de plus que ce qui est estimé pour le tunneling direct à travers des peptides de 5 nm, des alkyles ou un milieu diélectrique avec une constante diélectrique similaire. Il est donc probable que le processus de transport actuel soit plus complexe que le simple perçage d’un tunnel à travers une seule barrière. En effet, les protéines naturelles dont la fonction implique un transfert d’électrons ont souvent besoin de transférer des électrons avec une spécificité directionnelle élevée sur de grandes distances. Un tel transfert sur des distances plus longues implique toujours une chaîne de cofacteurs, tels que des centres redox (22). Par analogie avec ces centres redox, nous pouvons considérer la rétine, le système d’électrons π qui se trouve au centre de bR, comme un intermédiaire sur le chemin des électrons à travers la protéine. Si, au lieu de percer un tunnel à travers une longue molécule, le processus se déroule en (au moins) deux étapes, avec une station de voie électronique délocalisée à 2,3 nm de chaque côté, des estimations similaires à celles utilisées ci-dessus donnent des courants de ≈10-20 A par 35 nm2 (21).

Pour vérifier expérimentalement cette dernière idée, nous avons préparé et examiné des jonctions de membranes bR sans rétine. Pour préparer ces membranes, nous avons d’abord illuminé la protéine mélangée à de l’hydroxylamine. Cette réaction conduit à rompre la liaison de base de Schiff protonée, donnant la bactérioopsine apo-protéique (BO) et la rétinaloxime, qui reste attachée à la membrane (12). La rétinaloxime a ensuite été éliminée par remise en suspension des apo-membranes dans une solution de BSA, suivie d’une incubation et d’une centrifugation. La BSA solubilise de manière compétitive la rétinaloxime qui est incorporée dans la membrane. Des lavages répétés par centrifugation éliminent le BSA une fois que la protéine a été purifiée de tous les contaminants chromophores (5). Le flux de courant à travers la membrane apo (sans rétine) est d’environ trois ordres de grandeur inférieur à celui observé avec les membranes bR natives (voir Fig. 4 Bis et 3 Bis). Le courant était très bruyant et instable. Ce résultat soutient l’idée que le courant circule principalement à travers les protéines bR et que la rétine sert de médiateur de transport du courant. De plus, le photo-effet observé avec les membranes natives contenant du bR peut être attribué à la rétine.

Fig. 4.

Caractéristiques I–V des jonctions métal-apo-membrane-métal. (A) Caractéristique I–V typique d’une jonction Au / apo-membrane (sans rétine) / (APTMS-AlOx–Al) préparée par fusion de vésicules et mesurée aux conditions ambiantes. (B) Courbes I–V de jonction Au/apo-membrane (apo-protéine bR plus rétinaloxime) / (APTMS–AlOx–Al) préparées par fusion de vésicules et mesurées aux conditions ambiantes dans l’obscurité et lors de l’éclairage à λ> 550 nm. Aucun effet photo sur le courant de jonction n’a été observé.

Pour vérifier si la liaison covalente rétinienne-protéine est une condition préalable au transport d’électrons, nous avons mesuré des échantillons apo-membranaires contenant de la rétinaloxime. Au moins une partie de la rétinaloxime occupera toujours le site de liaison de la rétine tel que déduit de la spectroscopie CD (23). Les courbes I-V de ces échantillons ont montré un comportement similaire à celui du bR natif en termes de magnitude de courant, mais elles n’ont montré aucune réponse à la lumière verte comme prévu dans les échantillons dépourvus d’absorption dans cette région (Fig. 4 B). Les caractéristiques I-V sont plus proches de linéaires que ce que nous trouvons pour les échantillons de type sauvage, ce qui peut indiquer un changement de l’écart de tunnel entre la rétine et la rétinaloxime.

Pour mieux comprendre l’effet de l’isomérisation rétinienne et du photocycle sur l’effet de lumière, nous avons étudié des pigments artificiels dérivés de rétinaux verrouillés en 13-cis(3) (Schéma 1), où l’isomérisation critique en C 13 Image intégrée1C 14 est bloquée par une structure annulaire à 5 chaînons (24, 25). Des caractéristiques I-V similaires à celles obtenues avec des apo-membranes à oxime rétinienne sont trouvées pour ces pigments artificiels. L’absence de photoeffect dans les jonctions réalisées avec des apo-membranes est en accord avec l’absence de photocycle dans ces échantillons (24, 26), soutenant l’hypothèse que l’apparition d’une isomérisation rétinienne est une condition préalable à l’effet de lumière. Nous supposons qu’aucun changement conformationnel prononcé, induit par un champ électrique, ne se produit (c’est-à-dire que le bR restera natif) dans les champs ≤10 6 V / cm à travers la protéine atteinte dans nos expériences. Nous notons que l’électrode supérieure Au est semi-transparente pour la lumière verte. Par exemple, un film Au de 55 nm transmet ≈70% à ≈550 nm (27). Une origine physique possible du photoeffet à partir de la nanostructure nanogap, plane, métallique elle-même, par example par excitation de plasmon de surface, peut être exclue en toute sécurité (28). Sur la base de ces résultats et des résultats décrits ci-dessus, nous attribuons le photoeffet sur les courants de jonction à la photoisomérisation rétinienne 13-cis/tout-trans (4) et aux changements de conformation protéique qui en résultent. Nous notons que dans nos expériences, les électrons proviennent d’électrodes métalliques et traversent bR d’électrode en électrode sous tension appliquée, bR agissant comme un milieu de conduction électronique. À cet égard, bR diffère des systèmes tels que les centres de réaction photosynthétiques, dans lesquels le transfert d’électrons entre cofacteurs est photo-induit.

Il ressort clairement des calculs et, par exemple, du résultat négatif de la Fig. 4 R que le mécanisme n’est pas (seulement) un mécanisme de tunneling direct. Il est également peu probable qu’il s’agisse (uniquement) d’un saut au vu des résultats (à molécule unique) des travaux de Selzer et al. (29). Comment alors les électrons peuvent-ils traverser la protéine? Nos résultats expérimentaux indiquent clairement que le chromophore rétinien est un composant nécessaire au processus de conduction. Il est bien connu que la rétine est reliée au côté extracellulaire via un réseau lié en H, ce qui fournit probablement un chemin criblé électrostatiquement pour le transport de charge. Comme il existe également un bon couplage entre le côté rétinien et extracellulaire dans l’obscurité, ce chemin doit être présent indépendamment de l’éclairage. Sa présence peut expliquer les courants plus élevés que prévu que nous mesurons. La connexion de la rétine à la surface cytoplasmique est connue pour être activée par la lumière, ce qui peut expliquer l’effet de lumière que nous observons. Ces deux suggestions nécessitent une enquête plus approfondie.

L’importance du transfert de charge entre le chromophore rétinien et l’environnement protéique pour le bR dans son état fondamental a été suggérée, sur la base de la théorie, par Sakai et al. (30). Ces auteurs ont émis l’hypothèse que le chromophore est stabilisé dans bR par une interaction de ses orbitales moléculaires les plus occupées et les plus basses inoccupées avec l’environnement protéique. Si une charge suffisante est transférée entre deux sites, en raison de la forte interaction orbitale moléculaire occupée la plus élevée et la plus faible inoccupée, le chromophore (conjugué π) peut être considéré comme une espèce réduite / oxydée à un électron (s’il se comporte comme un accepteur / donneur d’électrons). L’interaction chromophore–protéine la plus probable a été calculée par l’intermédiaire du réseau lié au H le long de la voie présumée des protons.

Il est également tentant de suggérer que le transport d’électrons couplés au proton (22, 31) joue un rôle car il existe des chaînes d’eau protonées quasi unidimensionnelles dans le canal à protons de bR (32, 33) noyées dans des bicouches lipidiques supportées solides, ce qui sera normal aux deux électrodes de notre configuration (17). Cette suggestion peut expliquer en partie la différence entre le transport d’électrons par bR et par des peptides supposés exempts d’eau. Face à une telle situation, plusieurs questions se posent.

  1. Dans quelle mesure le transport d’électrons par bR peut-il bénéficier d’un canal à protons intégré?

  2. Comment le chromophore et la structure protéique intermédiaire affecteront-ils le taux de transport des électrons à longue distance?

  3. Dans quelle mesure les molécules d’eau liées à l’intérieur de bR peuvent-elles contribuer au courant électronique?

Il est possible que des mesures I-V dépendantes de la température, bien que celles-ci soient loin d’être triviales avec ce système, puissent éclairer ces problèmes.

On remarque que, contrairement au cas d’une monocouche de bR en solution, le photocourant faradique d’une monocouche de bR sèche provenant de la translocation de protons transmembranaires est négligeable par rapport aux courants de jonction observés car la source de protons est limitée. Notre constatation que tous les courants de jonction observés (dans l’obscurité ou sous la lumière verte) sont nuls, dans les limites d’une erreur expérimentale, corrobore l’absence de translocation de protons à l’état stationnaire. Il n’y a donc pas de photoréponse mesurable entre environ ±30 mV à ≈0 V (cf. réf. 34; toute photovoltage ≤15 à 20 mV est dans le bruit de notre mesure), ce qui indique que la translocation de protons entraînée par la lumière à travers la monocouche bR maintenue entre les électrodes contribue de manière négligeable aux courants lumineux en régime permanent. Cette conclusion a été confirmée par les photocourants bR induits par la translocation des protons dans des bicouches lipidiques similaires à support solide (typiquement 4-8 nA/cm2) (18) qui sont de deux à trois ordres de grandeur inférieurs aux courants de jonction que nous mesurons ici (≈0,5–5 µA/cm2). Pourtant, même sans lien direct entre le transport de protons et d’électrons, on constate qu’une protéine qui, du point de vue de l’électrostatique (criblage), convient au transfert de protons, pourrait bien pouvoir utiliser le même mécanisme de criblage pour faciliter le transport d’électrons.

Nous pouvons également comparer nos résultats avec les photocourants précédemment rapportés à travers les multicouches sèches ≈500 nm (8) et ≈100 µm (9) en calculant des valeurs par monocouche PM (5 nm). Une telle normalisation donne des valeurs de ≈0,01 nA par couche de particules simples par cm2, i.e., environ quatre à cinq ordres de grandeur de moins que les courants de jonction que nous mesurons ici (≈0,5–5 µA/cm2). Cette différence spectaculaire illustre la difficulté à interpréter les mesures antérieures, pionnières (9), et souligne l’importance d’utiliser une configuration aussi bien définie que possible pour les mesures de transport d’électrons des systèmes biologiques. Avec de telles configurations, il devient alors également possible d’effectuer des mesures en fonction de variations contrôlées du système.

Résultats et discussion Une suspension de fragments de PM contenant du bR sauvage a été préparée (12) et reconstituée avec de la phosphatidylcholine d’œuf exogène (PC) en vésicules par une modification de la méthode de Racker (13). Pour vérifier davantage les caractéristiques courant-tension (I-V) dépendantes de la quantité de protéines, une autre suspension vésiculaire de…

Résultats et discussion Une suspension de fragments de PM contenant du bR sauvage a été préparée (12) et reconstituée avec de la phosphatidylcholine d’œuf exogène (PC) en vésicules par une modification de la méthode de Racker (13). Pour vérifier davantage les caractéristiques courant-tension (I-V) dépendantes de la quantité de protéines, une autre suspension vésiculaire de…

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