Bakteriorodopszin (bR) mint elektronikus vezető közeg: áramszállítás br-tartalmú egyrétegeken keresztül

eredmények és megbeszélés

vad típusú BR-t tartalmazó PM-fragmensek szuszpenzióját állítottuk elő (12), majd exogén tojásfoszfatidilkolinnal (PC) oldottuk fel vezikulákba a Racker módszerének módosításával (13). A fehérje-mennyiségtől függő áram-feszültség (I–V) jellemzőinek további ellenőrzésére egy másik vezikuláris bR szuszpenziót állítottunk elő oktil–tioglükozid (OTG) detergensként történő alkalmazásával (14). A natív bR-tartalmú membránok egyrétegeit ezután úgy állítottuk elő, hogy a vezikulákat Adszorbeáltuk egy Al szubsztrátumon (egy 50 nm-es vastagságú al-film kvarcon elpárolgott) egy természetes alumínium-oxid réteggel a felületén (itt Aloxként ábrázolva). A csatolt vezikulák ezután kinyílnak és összeolvadnak, szilárd hordozású lipid kettős rétegeket képezve. A vezikulák elektrosztatikus adszorpciójának elősegítése érdekében a szubsztrát felületét először (3-amino-propil)trimetoxiszilánnal (APTMS) (15) szilanizáltuk, majd 0,1 M HCl-lel kezeltük, hogy pozitív töltésű felületet kapjunk. Mind a bR/PC, mind a bR / OTG vezikulum szuszpenziók fény által indukált befelé irányuló protonpumpálást mutattak, amint azt korábban tapasztaltuk (13, 16). Ezen megfigyelés alapján posztuláljuk a BR preferenciális orientációját a citoplazmatikus oldallal szemben a szubsztrát felülete a vezikulum fúziója után bR egyrétegű membránok kialakításához, összhangban az orientációtól függő transzmembrán proton transzlokációval (17).

ábra. A 2 A ábra egy szubsztrátum reprezentatív AFM képét mutatja, amelyet bR-tartalmú fuzionált vezikulummembránok borítanak, amelyet a szubsztrátumon 10 perces adszorpcióval állítanak elő. Mivel nehéz elérni az ideális egyréteget (100%-os lefedettség), mindig vannak minta nélküli repedések vagy lyukak (általában tíz nanométer) az összeolvadt vezikulum membránok között. Ezek a repedések és lyukak elég kicsik ahhoz, hogy az Au pad (0,5 mm átmérőjű) áthidalja őket (szállítási mérésekhez), de elég nagyok ahhoz, hogy az AFM méréseink lehetővé tegyék a vastagság mérését. A szakaszelemzés azt mutatja, hogy a legmagasabb átlagos magassági jellemző 5,2 nm, ami jól illeszkedik az egyetlen PM tapasz vastagságához, jelezve a bR egyrétegű. A néhány fehér pöttyök ábra. 2 A maradék lapított vezikulák a film tetején. Sűrűbb bR egyrétegű tartalmazó membránok (ábra. 2 B)eredmény a hordozón lévő vezikulák 20 perces adszorpciója után. Fig. A 2B lehetővé teszi a membrán/egyrétegű vastagság véletlenszerű mérését is (5,1 nm a markerek között) a membrán túlzott száradás következtében fellépő repedése miatt. Hosszabb adszorpciós idők (>30 perc) többrétegű képződéshez vezettek. A módosított bR-vel rendelkező membránok egyrétegeit ugyanazon eljárások alkalmazásával állítottuk elő. Az elektromos szállítási mérésekhez szükséges összes mintát 20 perces adszorpcióval készítettük el, majd az AFM ellenőrizte az egyrétegű minőség biztosítása érdekében. Érdemes megemlíteni, hogy a felület által támogatott tiszta lipid kettős rétegekkel ellentétben, amelyek instabilak és szárításkor szétesnek (nem beszélve az N2 áramlás alatt történő szárításról) a lipidek közötti hidrofób kölcsönhatások elvesztése miatt száraz állapotban, az előkészített PC/bR membránok meglehetősen stabilak (még enyhe N2-szárítás után is), amint azt az AFM képek mutatják. Ezt a jelenséget a bR felületek magas negatív töltéseinek tulajdonítjuk, amelyek erősen kölcsönhatásba léphetnek a pozitív töltésű szubsztrát felületével, és állványként hatnak a lipid kettős rétegek merevítésére. Ez a kölcsönhatás teszi a kétrétegeket kellően robusztussá ahhoz, hogy lehetővé tegyék az elektrontranszport ismételt és reprodukálható vizsgálatát egyrétegű módon, környezeti körülmények között és szobahőmérsékleten.

ábra. 2.

br-tartalmú olvasztott membránok AFM képei. (Balra) reprezentatív AFM képek (2 ~ 2 ~ m) a BR-tartalmú vezikulák fuzionált membránjainak egyrétegeiről, 10 perces adszorpcióval készítve Al / AlOx szubsztrátumon, aptms-sel derivatizálva. (A jobb és B jobb) vonal Letapogatás átlagos magassága a legerősebb jellemzői 5,2 nm. A magassági sáv 20 nm-t fed le. (B balra) sűrűbben csomagolt bR, amely egyréteget tartalmaz, amelyet a hordozón lévő vezikulák 20 perces adszorpciójával állítanak elő (1,25-6,25-XNUMX-xnumxm kép). A membrán repedése, amelyet a túlzott szárítás indukál (amit gondosan elkerültek az elektromos szállítási mérésekhez használt minták előkészítése során), azt mutatja, hogy az egyrétegű vastagság 5,1 nm (markerek között).

az I–V méréseket sík csomóponti szerkezeteken végeztük egy 10000 osztályú tiszta helyiségben, 293k és 40% relatív páratartalom mellett, a mintát az Al / AlOx szubsztrátum és az Au érintkezők közé szorítva. Minden mintán több kicsi, 0,5 mm átmérőjű AU párnát helyeztek el az egyrétegen a LOFO technikával. Az áramkört úgy fejezzük be, hogy egy volfrámelektródát óvatosan helyezünk az aranyelektródra (11). A lofo technika alkalmazásának fő előnye a felső érintkezés előkészítéséhez, összehasonlítva a fém párolgási lerakódással vagy a higanykontaktusokkal, az, hogy az előformázott fémfoltok lebeghetnek és átfedhetnek néhány apró lyukon és repedésen (jellemzően tíz nanométerben), így az elektromos mérések sikeresek. Fig. A 3 A a kapott fém/(bR egyrétegű–lipidben kétrétegű)/fém csomópont tipikus I-V jellemzőit mutatja egy 6 V-os torzítási tartományban. Az I–V görbéket sötét egyensúlyi állapot után rögzítettük, majd zöld fénnyel történő besugárzással (ons > 550 nm, 20 mW/cm2). Sötétben 0,75 nA áramlik 1-V alkalmazott torzítás mellett. A zöld fénnyel történő állandó állapotú megvilágítás után az áram 0,75-ről 1,7 nA-ra növekszik 1-V alkalmazott torzítás mellett. Miután a zöld fényt blokkolták, az áram 2-3 perc alatt az eredeti sötét értékre romlott. Lehetséges, hogy a fényhatás összefügg a fotokémiailag indukált m köztitermék képződésével, amely száraz egyrétegű körülmények között lassabb termikus bomlással járhat, mint a (18) oldatban lévő membránokban. A rendszer e két állapot között váltogatható a zöld fény és a sötét adaptáció váltakozásával, ami azt jelzi, hogy a bR készítmény megtartja fotoaktivitását. Az Al/AlOx és Au érintkezők között csak APTMS egyréteggel rendelkező vezérlőberendezések mindig rövidre záródtak, tipikus csatlakozási ellenállásokkal <50 db, jelezve, hogy az AlO x rétegek elég vékonyak a megbízható elektromos mérésekhez.

ábra. 3.

a fém–(bR egyrétegű)–fém csomópontok i-V jellemzői. (A) Au/(wild–type bR)/(APTMS-AlOx–Al) csomópont i–v görbéi, amelyek orientált bR egyréteget tartalmaznak, vezikulumfúzióval készítve és sötétben környezeti körülmények között mérve, megvilágításkor a > 550 nm-nél, és sötét adaptáció. A nyilak azt mutatják, hogy az I–V válaszok ciklikusak lehetnek a két állapot között. Az Au pad területe 2,10 – 3 cm2 volt. (B) sötét áramok diagramja a +1,0-V előfeszítő feszültségen nyolc független csomópont számára, amelyeket bR/PC vezikulumokból, illetve bR/OTG vezikulumokból készítenek.

a BR döntő szerepét a mért transzmembránáramok előállításában egy másik, nagyobb bR-tartalmú egyrétegű membrán alkalmazásával szemléltetjük, amelyet a ref. 14 Az OTG-t mosószerként használva br vezikulumképződéshez. Ez a kétféle bR egyrétegű (különböző br tartalmú membránokat tartalmaz br / PC vagy bR / OTG vezikulumok) a vagy B membránként, valamint a vagy B csomópontként jegyezzük fel a megfelelő csomópontokhoz. A tipikus abszorbanciák (OD-ban) 560 nm-nél az a, illetve a B membrán esetében a 0,15-10-3, illetve az 1,0-10-3. A B membrán bR-tartalma (6-szor nagyobb, mint az A membráné) hasonló a száraz PM egyrétegű bR-tartalmához, mind a kísérleti abszorbancia (18), mind az ideális PM egyrétegű (1-10-3 OD, 560 nm-nél) érték alapján. Az átlagolt sötét áramok a B csomópontok adott alkalmazott elfogultságánál közel nyolcszor nagyobbak, mint az a csomópontoknál, azaz nagyon szorosan arányosak a membránok bR-tartalmával (ábra. 3 B). Ez a megállapítás arra utal, hogy az elektronok elsősorban a BR-n keresztül haladnak át a membránon, nem pedig a lipid kettős rétegeken. Mind az A, mind a B csomópont fotoaktív, és ha br–tartalomra normalizálják, hasonló i-V jellemzőket mutatnak.

az A és B csomópontok áramáramlására gyakorolt átlagos fényhatások jellemzően 1-V-os előfeszítés mellett, illetve 1-V-os torzítás mellett 6 na-sak. A B csomópont áramának fény által kiváltott változása a vártnál valamivel alacsonyabb, a kétféle minta bR tartalma alapján. A különbség oka lehet az M intermedier frakcióinak különbségei, amelyek felhalmozódhatnak az A és B mintákban, és/vagy a két minta közötti különbségek a foto-indukált fehérje konformációs változásban, amelyet az M képződés okoz.

az 5 nm vastag fehérjén átáramló mérhető áram figyelemre méltó, összehasonlítva más hasonló, azonos résű rendszerekkel. Megjegyezzük például, hogy egy tipikus 1 nm hosszú peptid áthalad a 12 nA-n 0,5 V (19) mellett, hasonlóan ahhoz, amelyet egyetlen 1,2 nm hosszú oktánszámú ditiol (20) halad át. Az összes többi tényező egyenlő, és feltételezve, hogy az (alagút) áram exponenciális csökkenése a molekula hosszának növekedésével, 10-23 a áramot eredményez egy 35 nm2-es (egy bR trimer plusz lipidek területének megfelelő) területre, a Simmons modellt használva a közvetlen alagúthoz (lásd a 2.szakaszt és a 2. ábrát a ref. 21). Optikai abszorpciós adataink alapján becsüljük meg a membránjainkban a bR sűrűségét 609 bR trimer / 0,002-cm2 csomópont. Ez az érték egy kísérletileg mért áramerősséget jelent, amely bR trimerenként 3 60-19 a, azaz., legalább négy nagyságrenddel több, mint amit az 5 nm-es peptideken, alkileken vagy hasonló dielektromos állandóval rendelkező dielektromos közegen keresztüli közvetlen alagútépítésre becsülnek. Ezért valószínű, hogy a jelenlegi szállítás folyamata összetettebb, mint az egyetlen akadályon keresztüli egyszerű alagút. Valójában a természetes fehérjéknek, amelyek funkciója magában foglalja az elektrontranszfert, gyakran nagy irányú specifitású elektronokat kell átvinniük nagy távolságokra. Az ilyen nagyobb távolságokon történő átvitel mindig magában foglalja a kofaktorok láncát, például a redox központokat (22). Ezeknek a redox központoknak az analógiájára tekinthetjük a retinát, a BR központjában lévő 6-elektron rendszert, mint köztiterméket az elektronok útján a fehérjén keresztül. Ha egy hosszú molekulán keresztül történő alagút helyett a folyamat (legalább) két lépésben történik, mindkét oldalról 2,3 nm-es delokalizált elektronútállomással, a fentiekhez hasonló becslések 10-20 a / 35 nm2 (21) .

Ez utóbbi ötlet kísérleti ellenőrzéséhez előkészítettük és megvizsgáltuk a retina nélküli bR membránok csomópontjait. Ezen membránok elkészítéséhez először megvilágítottuk a hidroxilaminnal kevert fehérjét. Ez a reakció a protonált Schiff-bázis kötés megszakításához vezet, így az Apo-fehérje bakterioopszin (BO) és retinaloxim keletkezik, amely a membránhoz kapcsolódik (12). A retinaloximot ezután úgy távolítottuk el, hogy az apo-membránokat BSA oldatban reszuszpendáltuk, majd inkubálást és centrifugálást végeztünk. A BSA versenyképesen oldja a retinaloximot, amely be van ágyazva a membránba. Az ismételt centrifugamosások eltávolítják a BSA-t, miután a fehérjét megtisztították az összes kromofor szennyeződéstől (5). A (retina nélküli) apo-membránon keresztüli áram körülbelül három nagyságrenddel alacsonyabb, mint a natív bR membránoknál megfigyelték (hasonlítsa össze az ábrákat. 4 A és 3 a). Az áramlat nagyon zajos és instabil volt. Ez az eredmény alátámasztja azt az elképzelést, hogy az áram dominánsan áramlik a bR fehérjéken keresztül, és hogy a retina aktuális transzport mediátorként szolgál. Ezenkívül a natív bR-tartalmú membránokkal megfigyelt fotohatás a retinának tulajdonítható.

ábra. 4.

a fém-apo-membrán-fém csomópontok i-V jellemzői. A) Au/apo–membrán (retina-mentes)/(APTMS-AlOx–Al) csomópont tipikus I–V jellemzője, amelyet vezikulumfúzióval állítanak elő és környezeti körülmények között mérnek. (B) Au/apo–membrán(apo-protein bR plusz retinaloxim)/(APTMS-AlOx–Al) csomópont i–V görbéi vezikulumfúzióval készítve, sötétben környezeti körülmények között mérve, megvilágításkor pedig az alábbi helyen: > 550 nm. Nem figyeltek meg fotohatást a csomópont áramára.

annak ellenőrzésére, hogy a retina–fehérje kovalens kötés előfeltétele-e az elektrontranszportnak, retinaloximot tartalmazó apo-membrán mintákat mértünk. A retinaloxim legalább egy része továbbra is elfoglalja a retina kötőhelyét, amint azt a CD spektroszkópiából levezetjük (23). Az ilyen minták I–V görbéi a jelenlegi nagyság szempontjából hasonló viselkedést mutattak, mint a natív bR, de nem mutattak semmilyen választ a zöld fényre, amint az várható volt az abszorpció nélküli mintákban ebben a régióban (ábra. 4 B). Az I-V jellemzői közelebb állnak a lineárishoz, mint amit a vad típusú mintáknál találunk, ami a retina és a retinaloxim közötti alagút rés változását jelezheti.

a retina izomerizációjának és a fotociklusnak a fényhatásra gyakorolt hatásának további megvilágítására 13-cisz (3) zárolt retinálokból származó mesterséges pigmenteket vizsgáltunk (1.séma), ahol a kritikus C 13 beágyazott kép1C 14 izomerizációt egy 5 tagú gyűrűszerkezet blokkolja (24, 25). A retina oximmal rendelkező apo–membránokkal kapott i-V tulajdonságokhoz hasonló I-V jellemzők találhatók azoknál a mesterséges pigmenteknél. A fotohatás hiánya az apo-membránokkal készített csomópontokban összhangban van a fotociklus hiányával ezekben a mintákban (24, 26), alátámasztva azt a hipotézist, hogy a retina izomerizációjának előfordulása a fényhatás előfeltétele. Feltételezzük, hogy nincs kifejezett, elektromos mező által indukált, bR konformációs változás következik be (azaz a bR natív marad) a fehérje 10 6 V/cm-es területein, amelyeket a kísérleteink során elértünk. Megjegyezzük, hogy az Au felső elektróda félig átlátszó a zöld fény számára. Például egy 55 nm-es au film 70% – ot továbbít 550 nm-en (27). A fotoeffektus lehetséges fizikai eredete magából a nanogapból, síkból, fém nanostruktúrából, például felületi plazmon gerjesztéssel, biztonságosan kizárható (28). Ezek és a fent leírt eredmények alapján a csatlakozási áramokra gyakorolt fotohatást a 13-cisz/all-transz retina fotoizomerizációjának (4) és az ebből eredő fehérje konformációs változásoknak tulajdonítjuk. Megjegyezzük, hogy kísérleteink során az elektronok fémelektródákból származnak, és az alkalmazott feszültség alatt áthaladnak a bR-en az elektródról az elektródára, a bR pedig elektronikus vezető közegként működik. Ebben a tekintetben a bR különbözik az olyan rendszerektől, mint a fotoszintetikus reakcióközpontok, amelyekben a kofaktorok közötti elektrontranszfer fotoindukált.

a számításokból, például az ábra negatív eredményéből következik. 4 a hogy a mechanizmus nem (csak) az egyik közvetlen alagút. Nem valószínű ,hogy (kizárólag) az egyik ugráló, tekintettel a Selzer et al. (29). Hogyan tudnak az elektronok átjutni a fehérjén? Kísérleti eredményeink egyértelműen azt mutatják, hogy a retina kromofor a vezetési folyamat szükséges alkotóeleme. Köztudott, hogy a retina h-kötésű hálózaton keresztül kapcsolódik az extracelluláris oldalhoz, amely valószínűleg elektrosztatikusan átvilágított utat biztosít a töltés szállításához. Mivel sötétben a retina és az extracelluláris oldal között is jó kapcsolat van, ennek az útnak a megvilágítástól függetlenül jelen kell lennie. Jelenléte megmagyarázhatja a vártnál magasabb áramokat, amelyeket mérünk. A retina kapcsolódása a citoplazmatikus felülethez ismert, hogy fényaktivált, ami megmagyarázhatja a megfigyelt fényhatást. Mindkét javaslat további vizsgálatot igényel.

Az elmélet alapján Sakai et al. (30). Ezek a szerzők azt feltételezték, hogy a kromofor a BR-ben stabilizálódik a legmagasabb elfoglalt és a legalacsonyabb kihasználatlan molekuláris pályák kölcsönhatása a fehérje környezettel. Ha elegendő töltés kerül átadásra két hely között, az erős legmagasabb elfoglalt–legalacsonyabb kihasználatlan molekulapálya kölcsönhatás miatt, a (konjugált) kromofor egy elektronnal redukált/-oxidált fajnak tekinthető (ha elektron akceptorként/donorként viselkedik). A legvalószínűbb kromofor–fehérje kölcsönhatást a feltételezett protonút mentén a H-kötésű hálózaton keresztül számították ki.

az is csábító, hogy azt sugallják, hogy a proton-kapcsolt elektrontranszport (22, 31) szerepet játszik, mert a BR (32, 33) protoncsatornájában kvázi egydimenziós protonált vízláncok vannak beágyazva szilárd támogatott lipid kétrétegekbe, amelyek normálisak lesznek a felépítésünkben lévő két elektródra (17). Ez a javaslat magyarázhatja a bR-en keresztüli elektrontranszport és az állítólag vízmentes peptidek közötti különbség egy részét. Egy ilyen helyzetre tekintettel számos kérdés merül fel.

  1. mennyire, ha egyáltalán, az elektron transzport bR-en keresztül profitálhat egy beépített protoncsatornából?

  2. hogyan befolyásolja a kromofor és a beavatkozó fehérje szerkezete a nagy hatótávolságú elektrontranszport sebességét?

  3. milyen mértékben járulhatnak hozzá a BR-ben lévő kötött vízmolekulák az elektronikus áramhoz?

lehetséges, hogy a hőmérsékletfüggő I-V mérések, bár ezek messze nem triviálisak ezzel a rendszerrel, megvilágíthatják ezeket a kérdéseket.

megjegyezzük, hogy az oldatban lévő bR egyrétegű esetétől eltérően a transzmembrán proton transzlokációból származó száraz bR egyrétegű Faradai fotoáram elhanyagolható a megfigyelt csatlakozási áramokhoz képest, mivel a protonforrás korlátozott. Megállapításunk, hogy az összes megfigyelt csomóponti áram (sötétben vagy zöld fényben) nulla, kísérleti hibán belül , alátámasztja az egyensúlyi állapotú proton transzlokáció hiányát. Ezért nincs mérhető fotoreszponencia körülbelül 30 MV között, 0 V-nál (vö. ref. 34; bármely 15-20 mV – os fotovoltázs a mérésünk zajában van), jelezve, hogy a fényvezérelt proton transzlokáció az elektródák között tartott bR egyrétegen elhanyagolhatóan hozzájárul az egyensúlyi fényáramokhoz. Ezt a következtetést megerősítették a proton-transzlokáció által indukált bR fotoáramok hasonló szilárd hordozású lipid kétrétegekben (jellemzően 4-8 nA/cm2) (18), amelyek két–három nagyságrenddel alacsonyabbak, mint az itt mért csatlakozási áramok (0,5-5 ca/cm2). Mégis, még a proton és az elektrontranszport közötti közvetlen kapcsolat nélkül is megjegyezzük, hogy egy olyan fehérje, amely az elektrosztatika (szűrés) szempontjából alkalmas protonátadásra, képes lehet ugyanazt a szűrési mechanizmust használni az elektrontranszport megkönnyítésére.

eredményeinket összehasonlíthatjuk az 500 nm-es (8) és a 100 nm-es (9) száraz többrétegűeken keresztül korábban jelentett fotoáramokkal is, a PM-es egyrétegű (5 nm) értékek kiszámításával. Az ilyen normalizálás 0,01 na / PM réteg / cm2 értéket eredményez, azaz., körülbelül négy-öt nagyságrenddel kevesebb, mint az itt mért csatlakozási áramok (0,5–5!!/cm2). Ez a drámai különbség szemlélteti a korábbi, úttörő mérések értelmezésének nehézségeit (9), és hangsúlyozza annak fontosságát, hogy a biológiai rendszerek elektrontranszport-méréseihez a lehető legjobban meghatározott konfigurációt használják. Ilyen konfigurációkkal lehetővé válik a mérések elvégzése a rendszer ellenőrzött variációinak függvényében.

eredmények és megbeszélés vad típusú BR-t tartalmazó PM-fragmensek szuszpenzióját állítottuk elő (12), majd exogén tojásfoszfatidilkolinnal (PC) oldottuk fel vezikulákba a Racker módszerének módosításával (13). A fehérje-mennyiségtől függő áram-feszültség (I–V) jellemzőinek további ellenőrzésére egy másik vezikuláris bR szuszpenziót állítottunk elő oktil–tioglükozid (OTG) detergensként történő alkalmazásával (14). A natív bR-tartalmú membránok egyrétegeit ezután úgy állítottuk elő, hogy…

eredmények és megbeszélés vad típusú BR-t tartalmazó PM-fragmensek szuszpenzióját állítottuk elő (12), majd exogén tojásfoszfatidilkolinnal (PC) oldottuk fel vezikulákba a Racker módszerének módosításával (13). A fehérje-mennyiségtől függő áram-feszültség (I–V) jellemzőinek további ellenőrzésére egy másik vezikuláris bR szuszpenziót állítottunk elő oktil–tioglükozid (OTG) detergensként történő alkalmazásával (14). A natív bR-tartalmú membránok egyrétegeit ezután úgy állítottuk elő, hogy…

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.