Bacteriorhodopsin (bR) come mezzo di conduzione elettronica: Trasporto di corrente attraverso monostrati contenenti BR

Risultati e discussione

È stata preparata una sospensione di frammenti di PM contenenti BR wild-type (12) e ricostituita con fosfatidilcolina di uovo esogena (PC) in vescicole mediante una modifica del metodo di Racker (13). Per verificare ulteriormente le caratteristiche di corrente-tensione (I-V) dipendente dalla quantità di proteine, è stata preparata un’altra sospensione vescicolare BR utilizzando octylthioglucoside (OTG) come detergente (14). I monostrati delle membrane contenenti BR native sono stati quindi preparati adsorbendo le vescicole su un substrato di Al (un film di Al evaporato su quarzo con ≈50 nm) con uno strato di ossido di alluminio naturale sulla sua superficie (qui rappresentato come AlOx). Le vescicole allegate si aprono e si fondono, formando doppi strati lipidici supportati da solidi. Per promuovere l’adsorbimento elettrostatico delle vescicole, abbiamo prima silanizzato la superficie del substrato con (3-amminopropil)trimetossisilano (APTMS) (15), seguito da un trattamento con 0,1 M HCl, per ottenere una superficie caricata positivamente. Entrambe le sospensioni a vescicole bR / PC o BR / OTG hanno mostrato un pompaggio di protoni verso l’interno indotto dalla luce come è stato trovato in precedenza (13, 16). Sulla base di questa osservazione, postuliamo un orientamento preferenziale di bR con il lato citoplasmatico rivolto verso la superficie del substrato dopo la fusione delle vescicole per formare membrane monostrato bR, coerenti con la traslocazione transmembrana protonica dipendente dall’orientamento (17).

Fig. 2 A mostra un’immagine rappresentativa dell’AFM di un substrato, coperto da membrane vescicolari fuse contenenti bR, preparato mediante adsorbimento di 10 minuti sul substrato. Poiché è difficile ottenere un monostrato ideale (copertura del 100%), ci sono sempre alcune crepe o fori di spillo privi di campioni (in genere decine di nanometri), tra le membrane delle vescicole fuse. Queste fessure e fori di spillo sono abbastanza piccoli per il pad Au (diametro 0,5 mm) per colmarli (per la misurazione del trasporto) ma abbastanza grandi per le nostre misurazioni AFM per rendere possibili misurazioni dello spessore. L’analisi della sezione mostra che la caratteristica di altezza media più alta è ≈5,2 nm, che concorda bene con lo spessore di una singola patch PM, indicando la formazione di un monostrato bR. I pochi punti bianchi in Fig. 2 A sono rimasti vescicole appiattite sulla parte superiore del film. Membrane contenenti monostrato BR più dense (Fig. 2 B) risultato dopo ≈20-min adsorbimento delle vescicole sul substrato. Fico. 2 B consente anche una misura fortuita dello spessore della membrana / monostrato (5,1 nm tra i marcatori) a causa di una crepa nella membrana a seguito di eccessiva essiccazione. Tempi di adsorbimento più lunghi (>30 min) hanno portato alla formazione di multistrato. I monostrati di membrane con BR modificato sono stati preparati utilizzando le stesse procedure. Tutti i campioni per le misure di trasporto elettrico sono stati preparati da 20 min di adsorbimento e controllati da AFM per assicurare la qualità monostrato. Vale la pena ricordare che, a differenza dei doppi strati lipidici puri supportati dalla superficie, che sono instabili e si disintegrano all’essiccazione (per non parlare dell’essiccazione sotto flusso N2) a causa della perdita di interazioni idrofobiche tra lipidi allo stato secco, le membrane PC/bR così preparate sono piuttosto stabili (anche dopo una lieve essiccazione N2), come rivelato dalle immagini AFM. Attribuiamo questo fenomeno alle alte cariche negative sulle superfici bR, che possono interagire fortemente con la superficie del substrato caricata positivamente e fungere da impalcatura per irrigidire i doppi strati lipidici. Questa interazione rende i bistrati sufficientemente robusti da consentire studi di trasporto di elettroni ripetuti e riproducibili in modo monostrato in condizioni ambientali ea temperatura ambiente.

Fig. 2.

Immagini AFM di membrane fuse contenenti bR. (A sinistra) Immagini rappresentative AFM (2 × 2 µm) di monostrati di membrane fuse di vescicole contenenti bR, preparate mediante adsorbimento di 10 minuti su substrato Al/AlOx, derivatizzate con APTMS. (A destra e B destra) Scansioni di linea che mostrano un’altezza media delle caratteristiche più forti di ≈5,2 nm. La barra di altezza copre 20 nm. (B a sinistra) Un bR più densamente imballato contenente un monostrato, preparato mediante adsorbimento di 20 minuti di vescicole sul substrato (immagine 1,25- × 1,25-µm). La fessura nella membrana, indotta da un’eccessiva essiccazione (cosa che è stata accuratamente evitata nella preparazione dei campioni utilizzati per le misure di trasporto elettrico) mostra che il monostrato ha uno spessore di 5,1 nm (tra i marcatori).

Le misurazioni I–V sono state effettuate su strutture di giunzione planari in una camera bianca di classe 10000 a 293K e 40% di umidità relativa, con il campione inserito tra il substrato Al / AlOx e i contatti Au. Su ogni campione, diversi piccoli cuscinetti Au di 0,5 mm di diametro sono stati depositati sul monostrato con la tecnica LOFO. Il circuito viene completato posizionando delicatamente un elettrodo di tungsteno sull’elettrodo d’oro (11). Il vantaggio principale dell’utilizzo della tecnica LOFO per preparare il contatto superiore, rispetto alla deposizione di evaporazione del metallo o ai contatti di mercurio, è che le patch metalliche preformate possono galleggiare e coprire alcuni piccoli fori e fessure (in genere in decine di nanometri), rendendo le misurazioni elettriche riuscite. Fico. 3 A mostra le tipiche caratteristiche I-V di una giunzione metallo/(BR monostrato-in-lipidico doppio strato)/metallo risultante su un intervallo di polarizzazione ±1-V. Le curve I-V sono state registrate dopo l’equilibrazione del buio seguita da irradiazione con luce verde (λ > 550 nm, 20 mW/cm2). Al buio, è stato rilevato un flusso di 0,75 nA con un bias applicato a 1-V. Dopo l’illuminazione a stato stazionario con luce verde, la corrente aumenta da 0,75 a 1,7 nA con un bias applicato a 1 V. Una volta che la luce verde è stata bloccata, la corrente è decaduta per 2-3 min al suo valore scuro originale. Probabilmente, l’effetto della luce è associato alla formazione dell’intermedio M fotochimicamente indotto che potrebbe avere un decadimento termico più lento in condizioni di monostrato secco rispetto alle membrane in soluzione (18). Il sistema può essere pedalato tra questi due stati alternando luce verde e adattamento scuro, indicando che la preparazione bR mantiene la sua fotoattività. I dispositivi di controllo con solo un monostrato APTMS incorporato tra contatti Al / Alox e Au sono sempre stati cortocircuitati con resistenze di giunzione tipiche<50 Ω, indicando che gli strati ALO x sono abbastanza sottili per misurazioni elettriche affidabili.

Fig. 3.

I–V caratteristiche di metallo–(BR monostrato) – giunzioni metalliche. (A) Curve I–V di una giunzione Au/(wild-type bR)/(APTMS–AlOx–Al) contenente monostrato BR orientato, preparata per fusione di vescicole e misurata in condizioni ambientali al buio, dopo illuminazione a λ > 550 nm, e adattamento al buio. Le frecce mostrano che le risposte I-V possono essere ciclate tra i due stati. L’area del pad Au era di 2,10-3 cm2. (B) Trama di correnti scure a una tensione di polarizzazione +1.0-V per otto giunzioni indipendenti preparate da vescicole bR/PC e da vescicole BR/OTG, rispettivamente.

Il ruolo cruciale che BR svolge nella produzione delle correnti transmembrane misurate è illustrato utilizzando un’altra membrana monostrato con contenuto bR più elevato, che è stata preparata come riportato in ref. 14 utilizzando OTG come detergente per la formazione di vescicole bR. Questi due tipi di monostrato bR (contenenti membrane con diversi contenuti bR preparati da vescicole bR/PC o BR/OTG) saranno notati come membrana A o B e giunzione A o B per le giunzioni corrispondenti. Le assorbenze tipiche (in OD) a ≈560 nm sono ≈0,15 × 10-3 e ≈1,0 × 10-3 per le membrane A e B, rispettivamente. Il contenuto di BR della membrana B (≈6 volte superiore a quello della membrana A) è simile a quello di bR in un monostrato PM secco, basato sia sull’assorbanza sperimentale (18) che sul valore, calcolato per un monostrato PM ideale (≈1 × 10-3 OD a ≈560 nm). Le correnti scure mediate ad un dato bias applicato delle giunzioni B sono quasi otto volte quelle trovate con le giunzioni A, cioè molto strettamente proporzionali al contenuto di bR nelle membrane (Fig. 3 B). Questa scoperta suggerisce che gli elettroni passano principalmente attraverso bR attraverso la membrana piuttosto che attraverso i doppi strati lipidici. Entrambe le giunzioni A e B sono fotoattive e, quando normalizzate al contenuto bR, mostrano caratteristiche IV simili.

Gli effetti di luce medi sul flusso di corrente delle giunzioni A e B sono tipicamente ≈1 e ≈3 nA con un bias applicato a 1-V, rispettivamente. La variazione indotta dalla luce nella corrente di giunzione B è leggermente inferiore al previsto, in base al contenuto di bR dei due tipi di campioni. La differenza potrebbe essere dovuta a differenze nelle frazioni dell’intermedio M che possono accumularsi nei campioni A e B e / o con differenze tra i due campioni nel cambiamento di conformazione della proteina foto-indotta, imposto dalla formazione di M.

Il flusso di corrente misurabile attraverso la proteina spessa 5 nm è notevole, rispetto ad altri sistemi simili con lo stesso gap. Ad esempio, notiamo che un tipico peptide lungo 1 nm passerà ≈12 nA a 0,5 V (19), simile a quello passato da un singolo ditiolo di ottano lungo 1,2 nm (20). Tutti gli altri fattori sono uguali e assumendo una diminuzione esponenziale della corrente (tunnel) con l’aumento della lunghezza della molecola, produce una corrente di ≈10-23 A per un’area ≈35-nm2 (equivalente all’area di un trimero BR più lipidi), utilizzando il modello di Simmons per il tunneling diretto (confrontare la sezione 2 e la figura 2 in ref. 21). Sulla base dei nostri dati di assorbimento ottico, stimiamo che la densità di bR nelle nostre membrane sia ≈109 BR trimero per giunzione 0,002-cm2. Questo valore si traduce in una corrente misurata sperimentalmente di 3 × 10-19 A per trimero bR, cioè, almeno quattro ordini di grandezza più di quello che è stimato per il tunneling diretto attraverso peptidi 5-nm, alchili o un mezzo dielettrico con costante dielettrica simile. È quindi probabile che il processo di trasporto attuale sia più complesso del semplice tunneling attraverso una singola barriera. Infatti, le proteine naturali la cui funzione comporta il trasferimento di elettroni spesso hanno bisogno di trasferire elettroni con elevata specificità direzionale su grandi distanze. Tale trasferimento su distanze più lunghe comporta sempre una catena di cofattori, come i centri redox (22). In analogia a questi centri redox, possiamo considerare la retina, il sistema π-elettrone che si trova al centro di bR, come intermedio sul percorso degli elettroni attraverso la proteina. Se, invece di tunneling attraverso una molecola lunga, il processo avviene in (almeno) due fasi, con una via-stazione elettrone delocalizzato 2,3 nm da ciascun lato, stime simili a quelle utilizzate sopra danno correnti di ≈10-20 A per 35 nm2 (21).

Per verificare sperimentalmente quest’ultima idea, abbiamo preparato ed esaminato le giunzioni delle membrane BR prive di retina. Per preparare queste membrane, abbiamo prima illuminato la proteina mescolata con idrossilammina. Questa reazione porta a rompere il legame protonato della base Schiff, producendo la batterioopsina apo-proteina (BO) e la retinaloxima, che rimane attaccata alla membrana (12). La retinaloxima è stata quindi rimossa risospendendo le membrane apo in una soluzione di BSA, seguita da incubazione e centrifugazione. BSA solubilizza competitivamente il retinaloxime che è incorporato all’interno della membrana. Lavaggi centrifughi ripetuti rimuovono il BSA una volta che la proteina è stata purificata da tutti i contaminanti cromofori (5). Il flusso di corrente attraverso la membrana apo (priva di retina) è di circa tre ordini di grandezza inferiore a quello osservato con le membrane BR native (confronta Figs. 4 A e 3 A). La corrente era molto rumorosa e instabile. Questo risultato supporta l’idea che la corrente scorre prevalentemente attraverso le proteine bR e che la retina funge da mediatore di trasporto corrente. Inoltre, il fotoeffetto osservato con le membrane contenenti BR native può essere attribuito alla retina.

Fig. 4.

I–V caratteristiche delle giunzioni metallo-apo-membrana-metallo. (A) Caratteristica I–V tipica di una giunzione Au/apo-membrana(priva di retina)/(APTMS-AlOx–Al) preparata per fusione vescicolare e misurata in condizioni ambientali. B) Curve I-V della giunzione Au/apo-membrana (apo-proteina bR più retinaloxima)/(APTMS–AlOx–Al) preparata per fusione vescicolare e misurata in condizioni ambientali al buio e all’illuminazione a λ > 550 nm. Non è stato osservato alcun effetto fotoelettrico sulla corrente di giunzione.

Per verificare se il legame covalente retinico–proteina è un prerequisito per il trasporto di elettroni, abbiamo misurato campioni di membrana apo contenenti retinaloxima. Almeno una parte della retinaloxima occuperà ancora il sito di legame retinico come dedotto dalla spettroscopia CD (23). Le curve I-V di tali campioni hanno mostrato un comportamento simile a quello del BR nativo in termini di grandezza corrente, ma non hanno mostrato alcuna risposta alla luce verde come previsto nei campioni privi di assorbimento in questa regione (Fig. 4 B). Le caratteristiche I-V sono più vicini a lineare di quello che troviamo per i campioni wild-type, che può indicare un cambiamento di gap tunneling tra retinal e retinaloxime.

Per fare ulteriore luce sull’effetto dell’isomerizzazione della retina e del fotociclo sull’effetto della luce, abbiamo studiato pigmenti artificiali derivati da retinali 13-cis (3)-locked (Schema 1), dove l’isomerizzazione C 13 Immagine incorporata 1C 14 è bloccata da una struttura ad anello a 5 membri (24, 25). Caratteristiche I-V simili a quelle ottenute con apo-membrane con ossima retinica si trovano per quei pigmenti artificiali. La mancanza di fotoeffetto nelle giunzioni fatte con apo-membrane è in linea con l’assenza di un fotociclo in questi campioni (24, 26), sostenendo l’ipotesi che il verificarsi di isomerizzazione retinica sia un prerequisito per l’effetto della luce. Assumiamo che non si verifichi alcun cambiamento conformazionale pronunciato, indotto dal campo elettrico, bR (cioè, BR rimarrà nativo) nei campi ≤10 6 V / cm attraverso la proteina raggiunta nei nostri esperimenti. Notiamo che l’elettrodo superiore Au è semitrasparente per la luce verde. Ad esempio, un film Au da 55 nm trasmette ≈70% a ≈550 nm (27). Una possibile origine fisica del fotoeffetto dalla nanostruttura nanogap, planare, metallica stessa, ad esempio mediante eccitazione plasmonica superficiale, può essere esclusa in modo sicuro (28). Sulla base di questi e dei risultati sopra descritti, attribuiamo il fotoeffetto sulle correnti di giunzione alla fotoisomerizzazione retinica 13-cis / all-trans (4) e ai cambiamenti conformazionali proteici che ne derivano. Notiamo che nei nostri esperimenti gli elettroni provengono da elettrodi metallici e passano attraverso bR da un elettrodo all’altro sotto tensione applicata, con bR che funge da mezzo di conduzione elettronica. A questo proposito, bR differisce da sistemi come i centri di reazione fotosintetici, in cui il trasferimento di elettroni tra cofattori è fotoindotto.

È chiaro dai calcoli e, ad esempio, dal risultato negativo di Fig. 4 A che il meccanismo non è (solo) uno di tunneling diretto. È anche improbabile che sia (esclusivamente) uno dei salti in vista dei risultati (singola molecola) del lavoro di Selzer et al. (29). Come possono allora gli elettroni attraversare la proteina? I nostri risultati sperimentali indicano chiaramente che il cromoforo retinico è un componente necessario per il processo di conduzione. È noto che la retina è collegata al lato extracellulare tramite una rete H-bonded, che probabilmente fornisce un percorso schermato elettrostaticamente per il trasporto della carica. Poiché c’è anche un buon accoppiamento tra il lato retinico ed extracellulare al buio, questo percorso deve essere presente indipendentemente dall’illuminazione. La sua presenza può spiegare le correnti più alte del previsto che misuriamo. La connessione della retina alla superficie citoplasmatica è nota per essere attivata dalla luce, il che può spiegare l’effetto della luce che osserviamo. Entrambi questi suggerimenti richiedono ulteriori indagini.

L’importanza del trasferimento di carica tra il cromoforo retinico e l’ambiente proteico per bR nel suo stato fondamentale è stata suggerita, sulla base della teoria, da Sakai et al. (30). Questi autori hanno ipotizzato che il cromoforo sia stabilizzato in bR da un’interazione dei suoi orbitali molecolari più occupati e più bassi non occupati con l’ambiente proteico. Se una carica sufficiente viene trasferita tra due siti, a causa della forte interazione orbitale molecolare occupata più alta-più bassa non occupata, il cromoforo (π-coniugato) può essere visto come una specie ridotta/ossidata da un elettrone (se si comporta come accettore/donatore di elettroni). L’interazione cromoforo–proteina più probabile è stata calcolata per essere tramite la rete H-bonded lungo la presunta via protonica.

Si è anche tentati di suggerire che il trasporto di elettroni accoppiato a protoni (22, 31) gioca un ruolo perché ci sono catene idriche protonate quasi unidimensionali nel canale protonico di bR (32, 33) incorporate in doppi strati lipidici supportati solidi, che saranno normali per i due elettrodi nel nostro set-up (17). Questo suggerimento può spiegare parte della differenza tra il trasporto di elettroni attraverso bR e attraverso peptidi presumibilmente privi di acqua. In considerazione di tale situazione sorgono diverse domande.

  1. Quanto, se non del tutto, il trasporto di elettroni attraverso bR può beneficiare di un canale protonico integrato?

  2. In che modo il cromoforo e la struttura delle proteine intervenienti influenzeranno il tasso di trasporto degli elettroni a lungo raggio?

  3. In che misura le molecole d’acqua legate all’interno di bR possono contribuire alla corrente elettronica?

Forse, le misurazioni I-V dipendenti dalla temperatura, sebbene queste siano tutt’altro che banali con questo sistema, possono far luce su questi problemi.

Notiamo che, a differenza del caso di un monostrato bR in soluzione, la fotocorrente faradaica di un monostrato BR secco originato dalla traslocazione di protoni transmembrana è trascurabile rispetto alle correnti di giunzione osservate perché la sorgente di protoni è limitata. La nostra scoperta che tutte le correnti di giunzione osservate (al buio o sotto la luce verde) sono zero, all’interno di un errore sperimentale , supporta l’assenza di traslocazione di protoni allo stato stazionario. Non vi è quindi alcuna fotorisposta misurabile tra circa ±30 mV a ≈0 V (cfr. rif. 34; qualsiasi fotovoltaggio da ≤15 a 20 mV è nel rumore della nostra misurazione), indicando che la traslocazione di protoni guidata dalla luce attraverso il monostrato bR tenuto tra gli elettrodi contribuisce in modo negligente alle correnti di luce stazionaria. Questa conclusione è stata confermata dalle fotocorrenti BR indotte dalla traslocazione di protoni in bistrati lipidici simili supportati da solidi (tipicamente 4-8 nA/cm2) (18) che sono da due a tre ordini di grandezza inferiori alle correnti di giunzione che misuriamo qui (≈0,5-5 µA/cm2). Tuttavia, anche senza alcuna connessione diretta tra trasporto di protoni ed elettroni, notiamo che una proteina che, dal punto di elettrostatica (screening), è adatta al trasferimento di protoni, potrebbe essere in grado di utilizzare lo stesso meccanismo di screening per facilitare il trasporto di elettroni.

Possiamo anche confrontare i nostri risultati con le fotocorrenti precedentemente riportate attraverso i multistrati a secco ≈500-nm (8) e ≈100-µm (9) calcolando i valori per monostrato PM (5 nm). Tale normalizzazione produce valori di ≈0,01 nA per singolo strato PM per cm2, cioè, circa quattro o cinque ordini di grandezza inferiori alle correnti di giunzione che misuriamo qui (≈0,5–5 µA/cm2). Questa drammatica differenza illustra la difficoltà di interpretare le misurazioni precedenti e pionieristiche (9) e sottolinea l’importanza di utilizzare una configurazione il più possibile definita per le misurazioni del trasporto di elettroni dei sistemi biologici. Con tali configurazioni, diventa anche possibile effettuare misurazioni in funzione delle variazioni controllate del sistema.

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