電子伝導媒体としてのバクテリオロドプシン(bR):bR含有単分子層を介した電流輸送

結果と考察

野生型bRを含むPM断片の懸濁液を調製し(12)、外因性卵ホスファチジルコリン(PC)でラッカー(13)の方法を改変して小胞に再構成した。 さらにタンパク質量依存電流電圧(I-V)特性をチェックするために、別の小胞bR懸濁液は、洗剤(14)としてオクチルチオグルコシド(OTG)を使用して調製した。 天然bR含有膜の単分子層は、その表面に天然酸化アルミニウムの層(ここではAlOxとして表される)とAl基板(石英上に蒸発したAlの≤50nm厚膜)上の小胞を吸着 付着した小胞は、次いで、開いて融合し、固体担持脂質二重層を形成する。 小胞の静電吸着を促進するために、我々は最初に(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン(APTMS)(15)で基板表面をシラン化し、0.1M HClで処理し、正に帯電した表面を得た。 BR/PCまたはbR/OTG小胞懸濁液の両方が、以前に発見されたように光誘起内向きプロトンポンプを示した(13、16)。 この観察に基づいて、我々は配向依存性膜貫通プロトン転座(17)と一致し、bR単層膜を形成するために小胞融合後の基板表面に面した細胞質側とbRの優先

図。 図2Aは、BR含有融合小胞膜によって覆われた、基板上に1 0分間吸着することによって調製された基板の代表的なA FM像を示す。 理想的な単分子層(100%被覆率)を得ることは困難であるため、融合した小胞膜の間には、常にサンプルフリーの亀裂またはピンホール(通常は数十ナノメートル)が これらの亀裂とピンホールは、Auパッド(直径0.5mm)がそれらを橋渡しするのに十分小さい(輸送測定用)が、AFM測定で厚さ測定を可能にするのに十分な大き セクション分析は、bR単分子層の形成を示す、単一のPMパッチの厚さとよく一致する≤5.2nmであるために最高の平均高さの特徴を示しています。 図中のいくつかの白い点。 図2Aは、フィルムの上に残された平坦化された小胞である。 より密度の高いbR単分子層含有膜(Fig. 2B)基質の小胞の≥20分の吸着の後の結果。 図1.1.1. 2Bはまた余分な乾燥の結果として膜のひびのために膜/単層の厚さ(マーカー間の5.1nm)の偶然の測定を可能にする。 より長い吸着時間(>30分)は多層形成につながった。 修飾brを有する膜の単分子層を同じ手順を用いて調製した。 電気輸送の測定のためのすべてのサンプルは吸着の20分によって準備され、単分子層の質を保証するためにAFMによって点検されました。 表面担持純脂質二重層とは異なり、乾燥状態の脂質間の疎水性相互作用の損失のために不安定であり、乾燥時に崩壊する(n2フロー下での乾燥はおろか)、調製したままのPC/bR膜は、AFM画像によって明らかにされているように、かなり安定である(軽度のN2乾燥後であっても)。 この現象は,正に荷電した基質表面と強く相互作用し,脂質二重層を硬化させる足場として作用するbr表面上の高い負電荷に起因する。 この相互作用により,二重層は十分にロバストになり,周囲条件下および室温で単分子層方式で繰り返し再現可能な電子輸送研究を可能にする。

図10に示すように、

2.

bR含有融合膜のAFM画像。 (左)A L/Alox基板上に1 0分吸着して調製したBR含有小胞の融合膜の単分子層の代表的なA FM画像(2×2μ m)を、APTMSで誘導体化した。 (右Aおよび右B)≤5.2nmの最も強い特徴の平均高さを示すラインスキャン。 高さ棒は20nmをカバーする。 (B左)単分子層を含むより密に充填されたbRを、基板上に小胞を20分間吸着させることによって調製した(1.25-×1.25-μ m画像)。 過度の乾燥(電気輸送測定に使用されるサンプルの調製において慎重に回避されたもの)によって誘発される膜の亀裂は、単分子層が5.1nmの厚さ(マー

I–V測定は、Al/AlOx基板とAu接点の間に挟まれたサンプルで、クラス10000クリーンルームで293Kと40%の相対湿度で平面接合構造上で行われました。 各サンプルでは、いくつかの小さな、0.5mm直径のAuパッドは、LOFO技術によって単分子層上に堆積した。 この回路は、金電極(11)上にタングステン電極を静かに配置することによって完了する。 LOFO技術を使用してトップコンタクトを準備することの主な利点は、金属蒸着や水銀コンタクトと比較して、事前に形成された金属パッチが浮遊し、いくつかの小さなピンホールや亀裂(通常は数十ナノメートル)にまたがることができ、電気的測定が成功することです。 図1.1.1. 図3Aは、±1−Vバイアス範囲にわたる、結果として生じる金属/(br単分子層−脂質二重層)/金属接合の典型的なi−V特性を示す。 暗平衡化の後、緑色(λ<div i d=”b2 5 6b1 6eeb”></div>5 5 0nm、2 0mW/cm2)の光を照射した後、I−V曲線を記録した。 暗闇の中では、0.75nAの流れが1-V印加バイアスで検出されました。 緑色の光で定常状態を照射した後、電流は0.75から1.7nAに1V印加バイアスで増加します。 緑色の光が遮断されると、電流は2〜3分で元の暗い値に減衰しました。 おそらく、光効果は、光化学的に誘導されたM中間体の形成に関連しており、溶液中の膜よりも乾燥単分子層条件下での熱崩壊が遅い可能性がある(18)。 この系は緑色光と暗順応を交互にすることによってこれら二つの状態の間を循環させることができ,br調製物がその光活性を保持することを示した。 Al/AlOxとAu接点の間に組み込まれたAPTMS単分子層のみを持つ制御デバイスは、常に典型的な接合抵抗<50Ωで短絡され、AlO x層が信頼性の高い電気測定のために十分に薄いことを示していた。

図10に示すように、

3.

金属–(bR単分子層)–金属接合のI–V特性。 (A)配向B r単分子層を含むA u/(野生型B r)/(APTMS−Alox−A l)接合のi−V曲線、小胞融合によって調製し、暗所での周囲条件で測定し、λ<div id=”b2 5 6b1 6eeb”></div>5 5 0nmでの照 矢印は、I–V応答が2つの状態の間で循環できることを示しています。 Auパッド面積は2.10-3cm2であった。 (B)bR/PC小胞およびbR/OTG小胞からそれぞれ調製された八つの独立した接合の+1.0Vバイアス電圧での暗電流のプロット。bRが測定された膜貫通電流を生成する上で果たす重要な役割は、より高いbR含有量を有する別の単分子層膜を使用することによって示されている。 BR小胞形成のための洗剤としてOTGを使用することにより、図1 4に示す。 これらの2種類のBr単分子層(Br/PCまたはBr/OTG小胞から調製された異なるBr含有量を有する膜を含む)は、対応する接合のための膜Aまたはbおよび接 ≦560nmでの典型的な吸光度(ODで)は、膜AおよびBについてそれぞれ≦0.15×10-3および≦1.0×10-3である。 膜BのbR含有量(膜Aのそれよりも≥6倍高い)は、実験吸光度(18)と理想的なPM単層(≤1×10-3OD at≤560nm)について計算された値の両方に基づいて、乾燥PM単層 接合Bの与えられた印加バイアスにおける平均化された暗電流は、接合Aで見られるもののほぼ8倍、すなわち膜中のbR含有量に非常に密接に比例しています(図1)。 3B)。 この知見は,電子が脂質二重層を通過するのではなく,主にbrを介して膜を通過することを示唆している。 接合Aとbの両方が光活性であり,br含有量に正規化すると,同様のi–V特性を示す。

接合AおよびBの電流の流れに対する平均光効果は、それぞれ1-V印加バイアスで、典型的には≦1および≦3nAである。

接合AおよびBの電 接合部B電流の光誘起変化は,二つのタイプの試料のbr含有量に基づいて予想よりも幾分低い。 この違いは,試料AおよびBに蓄積することができるM中間体の画分の違い,および/またはM形成によって課される光誘起蛋白質立体配座変化における二つの試料間の違いによるものと考えられた。

厚さ5nmのタンパク質を通る測定可能な電流の流れは、同じギャップを持つ他の同様のシステムと比較して顕著である。 例えば、我々は、典型的な1nmの長さのペプチドは、単一の1.2nmの長さのオクタンジチオール(20)によって渡されるものと同様に、0.5V(19)で≤12nAを通過するこ 他のすべての要因が等しく、分子長の増加に伴って(トンネル)電流が指数関数的に減少すると仮定すると、直接トンネリングのSimmonsモデルを使用して、≤10-23aの電流が35nm2の面積(bR三量体と脂質の面積に相当)で得られる(参照のセクション2と図2を比較してください。 21). 私達の光学吸収データに基づいて、私達は≤109bRの三量体0.002cm2接合箇所ごとであるために私達の膜のbRの密度を推定します。 この値は、bR三量体当たり3×10-19Aの実験的に測定された電流に変換される。、5nmのペプチド、アルキル、または同様の誘電率を持つ誘電体媒体を介して直接トンネリングのために推定されるものよりも少なくとも四桁以上。 したがって、電流輸送のプロセスは、単一の障壁を通る単純なトンネリングよりも複雑である可能性が高い。 実際、その機能が電子移動を伴う天然のタンパク質は、多くの場合、大きな距離にわたって高い指向性特異性を有する電子を移動させる必要があ より長い距離にわたるこのような移動は、常に酸化還元中心(22)のような補因子の連鎖を含む。 これらの酸化還元中心と同様に、我々は、タンパク質を介して電子の経路上の中間体として、bRの中心にある網膜、π電子系を考えることができます。 一つの長い分子をトンネルする代わりに、プロセスが(少なくとも)二つのステップで起こり、それぞれの側から非局在化された電子ウェイステーション2.3nmで、上記で使用されたものと同様の推定値は10-20nmあたり35nm2(21)の電流を与える。

この最後のアイデアを実験的に確認するために、網膜を含まないbR膜の接合部を調製し、検討した。 これらの膜を調製するために,まずヒドロキシルアミンと混合した蛋白質を照射した。 この反応は、プロトン化されたシッフ塩基結合を破壊し、膜に付着したままのアポ蛋白質バクテリオオプシン(BO)とレチナロキシムを生成する(12)。 次いで、bsaの溶液中でアポ膜を再懸濁し、続いてインキュベーションおよび遠心分離することにより、レチナロキシムを除去した。 BSAは膜の内で埋め込まれるretinaloximeを競争的に可溶化します。 タンパク質がすべての発色団汚染物質から精製されると、繰り返しの遠心分離機洗浄によりBSAが除去されます(5)。 (網膜を含まない)アポ膜を通る電流の流れは、天然のBR膜で観察されたものよりも約3桁低い(図1、2、3、4、5、6、7、8、9、1 0)。 4aおよび3A)。 現在は非常に騒々しいと不安定だった。 この結果は,電流がbr蛋白質を支配的に流れ,網膜が電流輸送メディエーターとして働くという考えを支持する。 さらに,天然のbr含有膜で観察された光効果は網膜に帰することができる。

図10に示すように、

4.

金属–アポ膜–金属接合のI-V特性。 (A)小胞融合によって調製され、周囲条件で測定されたA u/apo−膜(網膜を含まない)/(APTMS−Alox−A l)接合の典型的なi−V特性。 (B)小胞融合によって調製し、暗所および照明時に周囲条件で測定したa u/apo膜(apo−protein B r plus retinaloxime)/(APTMS−Alox−A l)接合部のi−V曲線をλ<div i d=”B2 5 6b1 6eeb”></div>5 5 0nmで測定した。 接合電流に対する光効果は観察されなかった。

網膜–タンパク質共有結合が電子輸送の前提条件であるかどうかを確認するために、我々はレチナロキシムを含むアポ膜試料を測定した。 レチナロキシムの少なくとも一部は、CD分光法から推定されるように、網膜結合部位を依然として占有する(2 3)。 このような試料のI-V曲線は、電流の大きさに関して天然のbRと同様の挙動を示したが、この領域で吸収を欠いている試料では予想されるように緑色光に応答しなかった(図1)。 4B)。 I-V特性は野生型試料よりも線形に近く,網膜とレチナロキシムの間のトンネリングギャップの変化を示していると考えられる。

網膜異性化と光サイクルが光効果に及ぼす影響をさらに明らかにするために、13-cis(3)-locked retinals(Scheme1)に由来する人工色素を研究し、臨界C13埋め込み画像1C14異性化は5員環構造によってブロックされている(24、25)。 これらの人工色素については,網膜オキシムを有するアポ膜で得られたものと同様のi–V特性が見出された。 アポ膜で作られた接合部における光効果の欠如は、網膜異性化の発生が光効果のための前提条件であるという仮説を支持し、これらのサンプル(24、26) 我々は、我々の実験で到達されているタンパク質全体の≥10 6V/cmフィールドでは顕著な、電界誘導、bRコンフォメーション変化が発生しないことを前提としてい A u上部電極は緑色光に対して半透明であることに留意した。 例えば、5 5nmのA u膜は、≦5 5 0nmで≦7 0%の透過率を有する(2 7)。 ナノギャップ、平面、金属ナノ構造自体からの光効果の可能性のある物理的起源は、例えば表面プラズモン励起によって、安全に排除することができる(28)。 これらと上記の結果に基づいて、我々は13-cis/all-trans網膜光異性化(4)とそれに起因するタンパク質の立体配座の変化に接合電流に光効果を帰する。 実験では,電子は金属電極から発生し,印加電圧下で電極から電極にbrを通過し,brは電子伝導媒体として作用することに注意した。 この点で、BRは、補因子間の電子移動が光誘起される光合成反応中心のような系とは異なる。

計算から、そして例えば、図の否定的な結果から明らかである。 この機構は、直接トンネリングの(唯一の)一つではないことを4A。 また、Selzerらの研究の(単一分子)結果を考慮すると、(単独で)ホッピングの1つである可能性は低い。 (29). どのようにして電子がタンパク質を横断することができますか? これらの実験結果は,網膜発色団が伝導過程に必要な成分であることを明確に示している。 網膜はH結合ネットワークを介して細胞外側に接続されていることはよく知られており,これはおそらく電荷輸送のための静電的にスクリーニングされた経路を提供する。 暗所では網膜側と細胞外側との間にも良好な結合があるため、この経路は照明に関係なく存在しなければならない。 その存在は、私たちが測定する予想よりも高い電流を説明することができます。 網膜の細胞質表面への接続は光活性化されることが知られており、これは我々が観察する光効果を説明する可能性がある。 これらの提案の両方は、さらなる調査が必要です。

網膜発色団とその基底状態におけるbRのタンパク質環境との間の電荷移動の重要性は、理論に基づいて、Sakaiらによって示唆された。 (30). これらの著者らは、発色団は、その最高占有と最低占有されていない分子軌道とタンパク質環境との相互作用によってbRで安定化されると仮定した。 十分な電荷が二つのサイト間で移動する場合、強い最高占有–最低占有されていない分子軌道相互作用のために、(π共役)発色団は、一電子還元/酸化種と見なすことができる(電子受容体/ドナーとして振る舞う場合)。 最も可能性の高い発色団–蛋白質相互作用は,推定されるプロトン経路に沿ったH結合ネットワークを介していると計算した。

また、プロトン結合電子輸送(22、31)が役割を果たしていることを示唆することも魅力的です。bR(32、33)のプロトンチャネルには準一次元のプロトン化された水鎖があり、これは私たちのセットアップ(17)では二つの電極に正常である。 この提案は,brを介した電子輸送とおそらく水を含まないペプチドを介した電子輸送の違いの一部を説明することができる。 このような状況を考慮して、いくつかの疑問が生じる。bRを介した電子輸送は、内蔵の陽子チャネルからどれくらいの利益を得ることができますか?発色団と介在するタンパク質構造は、長距離電子輸送の速度にどのように影響するのでしょうか?

  • bR内の結合した水分子は、電子電流にどの程度寄与することができますか?

  • 電子電流にどの程度寄与することができますか?

  • おそらく、温度依存のI-V測定は、このシステムでは些細なことではありませんが、これらの問題を明らかにすることができます。

    溶液中のbR単分子層の場合とは異なり、膜貫通プロトン転座に由来する乾燥bR単分子層のファラデー光電流は、プロトン源が限られているため、観測された接合電流と比較して無視できることに注意してください。 観測されたすべての接合電流(暗または緑色の光の下)が実験誤差の範囲内でゼロであることを我々の発見は、定常状態の陽子転座の欠如を支持する。 したがって、≤0Vで約±30mVの間に測定可能な光応答はありません(cf. 参照。 34; 任意の≥15-20mV光起電力は、私たちの測定のノイズにあります)、電極間に保持されたbR単分子層全体の光駆動プロトン転座は、定常状態の光電流に無視 この結論は、我々がここで測定する接合電流(≧0.5-5μ a/cm2)よりも二から三桁低い同様の固体支持脂質二重層(典型的には4-8nA/cm2)(18)におけるプロトン転 それでも、プロトンと電子輸送の間に直接接続することなく、我々は、静電気学(スクリーニング)の点から、プロトン輸送に適しているタンパク質は、よく電子輸送を容易にするためにスクリーニングの同じメカニズムを使用することができるかもしれないことに注意してください。

    我々はまた、pm単分子層(5nm)あたりの値を計算することにより、≤500nm(8)と≤100μ m(9)乾燥多層膜を介して以前に報告された光電流と我々の結果を比較す このような正規化により、cm2あたりの単一PM層あたり≤0.01nAの値が得られます。 これは、ここで測定した接合電流(≧0.5–5μ A/cm2)よりも約4-5桁小さいことを意味します。 この劇的な違いは、以前の先駆的な測定(9)を解釈することの難しさを示し、生物系の電子輸送測定に可能な限り明確に定義された構成を使用することの重要性を強調している。 このような構成により、システムの制御された変動の関数として測定を行うことも可能になる。

    結果と考察 野生型bRを含むPM断片の懸濁液を調製し(12)、外因性卵ホスファチジルコリン(PC)でラッカー(13)の方法を改変して小胞に再構成した。 さらにタンパク質量依存電流電圧(I-V)特性をチェックするために、別…

    結果と考察 野生型bRを含むPM断片の懸濁液を調製し(12)、外因性卵ホスファチジルコリン(PC)でラッカー(13)の方法を改変して小胞に再構成した。 さらにタンパク質量依存電流電圧(I-V)特性をチェックするために、別…

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