Bacteriorhodopsin (bR) som et elektronisk ledningsmedium: Strømtransport gjennom br-inneholdende monolag

Resultater og Diskusjon

en suspensjon AV PM-fragmenter inneholdende villtype bR ble fremstilt (12) og rekonstituert med eksogent eggfosfatidylkolin (PC) i vesikler ved en modifikasjon Av Metoden Til Racker (13). For ytterligere å kontrollere egenskapene til proteinmengdeavhengig strømspenning (I-V) ble en annen vesikulær br-suspensjon fremstilt ved bruk av oktyltioglukosid (OTG) som vaskemiddel (14). Monolag av de innfødte bR-holdige membranene ble deretter fremstilt ved å adsorbere vesiklene på Et al-substrat (en ≈50 nm tykk film Av Al fordampet på kvarts) med et lag av naturlig aluminiumoksid på overflaten (representert her som AlOx). De vedlagte vesiklene åpnes og smelter, og danner solidstøttede lipidbilayers. For å fremme elektrostatisk adsorpsjon av vesiklene silaniserte vi først substratoverflaten med (3-aminopropyl)trimetoksysilan (APTM) (15), etterfulgt av behandling med 0,1 M HCl, for å oppnå en positivt ladet overflate. Både bR / PC eller bR/OTG vesikkel suspensjoner viste lysindusert innover protonpumping som ble funnet tidligere (13, 16). Basert på denne observasjonen postulerer vi en fortrinnsrettet orientering av bR med den cytoplasmatiske siden vendt mot substratoverflaten etter vesikkelfusjon for å danne bR monolagsmembraner, i samsvar med orienteringsavhengig transmembran protontranslokasjon (17).

Fig. 2 a viser et representativt AFM-bilde av et substrat, dekket av bR-inneholdende smeltede vesikelmembraner, fremstilt ved 10-min adsorpsjon på substratet. Fordi det er vanskelig å få et ideelt monolag (100% dekning), er det alltid noen prøvefrie sprekker eller pinholes (vanligvis titalls nanometer), mellom smeltede vesikkelmembraner. Disse sprekker og nålhull er små nok Til At Au-puten (0,5 mm diameter) kan bygge bro over dem (for transportmåling), men stor nok til AT VÅRE AFM-målinger kan gjøre tykkelsesmålinger mulig. Seksjonsanalyse viser den høyeste gjennomsnittlige høydefunksjonen til å være ≈5.2 nm, som stemmer godt med tykkelsen på et ENKELT PM-plaster, noe som indikerer dannelsen av et bR-monolag. De få hvite prikkene I Fig. 2 A er venstre flattede vesikler på toppen av filmen. Tettere bR monolagholdige membraner (Fig. 2 B) resultat etter ≈20-min adsorpsjon av vesiklene på underlaget. Fig. 2 B tillater også en tilfeldig måling av membran / monolags tykkelse (5,1 nm mellom markører) på grunn av en sprekk i membranen som følge av overdreven tørking. Lengre adsorpsjonstider (> 30 min) førte til flerlags dannelse. Monolag av membraner med modifisert bR ble fremstilt ved å bruke de samme prosedyrene. Alle prøver for elektriske transportmålinger ble utarbeidet med 20 min adsorpsjon og kontrollert AV AFM for å sikre monolagskvalitet. Det er verdt å nevne at, i motsetning til overflatestøttede rene lipid-bilag, som er ustabile og vil gå i oppløsning ved tørking (enn si tørking under N2-strømning) på grunn av tap av hydrofobe interaksjoner mellom lipider i tørr tilstand, ER DE as-forberedte PC/bR-membranene ganske stabile (selv etter mild N2-tørking), som avslørt AV AFM-bilder. Vi tilskriver dette fenomenet til de høye negative ladningene på bR-overflater, som kan samhandle sterkt med den positivt ladede substratoverflaten og fungere som et stillas for å stive lipidbilagene. Denne interaksjonen gjør bilayers tilstrekkelig robust til å tillate gjentatte og reproduserbare elektrontransportstudier i monolayer mote under omgivelsesforhold og ved romtemperatur.

Fig. 2.

AFM-bilder av bR-inneholdende smeltede membraner. (Til Venstre) Representative AFM-bilder (2 × 2 µ) av monolag av smeltede membraner av br-holdige vesikler, tilberedt ved 10 min adsorpsjon på Al/AlOx-substrat, derivatisert med APTM. (A høyre og B Høyre) Linjeskanninger som viser en gjennomsnittlig høyde på de sterkeste egenskapene til ≈5.2 nm. Høyden bar dekker 20 nm. (B Til Venstre) en mer tettpakket bR som inneholder et monolag, tilberedt ved 20 min adsorpsjon av vesikler på underlaget(1.25 – × 1.25-µ bilde). Sprekken i membranen, indusert av overdreven tørking (noe som ble nøye unngått ved utarbeidelsen av prøvene som ble brukt til elektriske transportmålinger) viser at monolaget er 5,1 nm tykt(mellom markører).I – v målinger ble utført på plane veikryss strukturer i en klasse-10000 rent rom PÅ 293k og 40% relativ fuktighet, med prøven klemt mellom al / AlOx underlaget og Au kontakter. På hver prøve ble flere små Au-pads med 0,5 mm diameter avsatt på monolaget VED LOFO-teknikken. Kretsen fullføres ved forsiktig å plassere en wolframelektrode på gullelektroden (11). Den største fordelen med Å bruke LOFO teknikken for å forberede topp kontakt, sammenlignet med metall fordampning deponering eller kvikksølv kontakter, er at preformed metall flekker kan flyte på og spenner noen små pinholes og sprekker (vanligvis i titalls nanometer), gjør elektriske målinger vellykket. Fig. 3 a viser typiske I-V-egenskaper for et resulterende metall/(br monolag-i-lipid dobbeltlag) / metallkryss over et ±1-V-biasområde. I – v-kurvene ble registrert etter mørk likevekt etterfulgt av bestråling med grønt (λ > 550 nm, 20 mW/cm2) lys. I mørket ble 0,75 nA flyter ved en 1-v påført bias detektert. Etter steady state-belysning med grønt lys øker strømmen fra 0,75 til 1,7 nA ved en 1-V påført bias. Når det grønne lyset ble blokkert, forfalt strømmen over 2-3 min til sin opprinnelige mørke verdi. Muligens er lyseffekten forbundet med dannelsen av det fotokjemisk induserte m-mellomproduktet som godt kan ha et langsommere termisk forfall under tørre monolagsforhold enn i membraner i oppløsning (18). Systemet kan sykles mellom disse to tilstandene ved vekslende grønt lys og mørk tilpasning, noe som indikerer at bR-preparatet beholder sin fotoaktivitet. Kontrollenheter med bare et aptms-monolag innlemmet mellom al / AlOx og Au-kontakter ble alltid kortsluttet med typiske kryssresistanser < 50 Ω, noe som indikerer At alo x-lagene er tynne nok til pålitelige elektriske målinger.

Fig. 3.

I-V egenskaper av metall – (bR monolayer)–metall veikryss. (A) I – v kurver Av En Au/(wild-type bR) / (aptms–AlOx–Al) veikryss inneholdende orientert bR monolag, fremstilt ved vesikelfusjon og målt ved omgivelsesforhold i mørket, ved belysning ved λ > 550 nm, og mørk tilpasning. Pilene viser at I – v-responsene kan sykles mellom de to tilstandene. Au pad-området var 2,10 – 3 cm2. (B) Plot av mørke strømmer ved a + 1.0-V bias spenning for åtte uavhengige veikryss fremstilt fra bR/PC vesikler og fra bR / OTG vesikler, henholdsvis.

den avgjørende rollen som bR spiller i å produsere de målte transmembranstrømmene er illustrert ved å bruke en annen monolagsmembran med høyere bR-innhold, som ble utarbeidet som rapportert i ref. 14 VED BRUK AV OTG som vaskemiddel for br vesikkeldannelse. Disse to typer br-monolag (som inneholder membraner med forskjellig bR-innhold fremstilt fra bR / PC eller bR/OTG vesikler) vil bli notert som membran A Eller B og kryss A Eller B for tilsvarende kryss. Typiske absorbanser (I OD) ved ≈560 nm er ≈0.15 × 10-3 og ≈1.0 × 10-3 for henholdsvis membran a og B. Br-innholdet i membran b (≈6 ganger høyere enn for membran A) ligner på bR i et tørt PM-monolag, basert på både eksperimentell absorpsjon (18) og verdien, beregnet for et ideelt PM-monolag (≈1 × 10-3 od ved ≈560 nm). Gjennomsnittlig mørke strømmer på en gitt anvendt skjevhet av veikryss B er nesten åtte ganger de som finnes med veikryss A, dvs. svært tett proporsjonal med bR innholdet i membraner (Fig. 3 B). Dette funnet antyder at elektroner passerer hovedsakelig via bR gjennom membranen i stedet for gjennom lipidbilagene. Begge kryssene A Og B er fotoaktive, og når de normaliseres til bR-innhold, viser de lignende iv-egenskaper.

de gjennomsnittlige lyseffektene på strømmen Av veikryss A Og B er vanligvis ≈1 og ≈3 nA ved henholdsvis 1-v påført skjevhet. Den lysinduserte endringen i kryss b-strøm er noe lavere enn forventet, basert på bR-innholdet i de to typer prøver. Forskjellen kan skyldes forskjeller i fraksjonene Av m-mellomproduktet som kan akkumuleres I prøver A Og B og / eller med forskjeller mellom de to prøvene i den fotoinducerte proteinkonformasjonsendringen, pålagt Av m-formasjonen.Målbar strøm gjennom det 5 nm tykke proteinet er bemerkelsesverdig, sammenlignet med andre lignende systemer med samme gap. For eksempel bemerker vi at et typisk 1 nm langt peptid vil passere ≈12 nA ved 0,5 V (19), tilsvarende det som passerte en enkelt 1,2 nm lang oktan dithiol (20). Alle andre faktorer som er like og antar en eksponentiell reduksjon i (tunnel) strøm med økende molekyllengde, gir en strøm av ≈10-23 A for et ≈35-nm2 område (tilsvarende arealet av en bR trimer pluss lipider), ved Hjelp Av Simmons-modellen for direkte tunneling (sammenlign seksjon 2 og figur 2 i ref. 21). Basert på våre optiske absorpsjonsdata estimerer vi tettheten av bR i våre membraner til å være ≈109 bR trimer per 0.002-cm2 kryss. Denne verdien oversettes til en eksperimentelt målt strøm på 3 × 10-19 a per bR trimer, dvs., minst fire størrelsesordener mer enn det som er estimert for direkte tunneling gjennom 5-nm peptider, alkyler eller et dielektrisk medium med lignende dielektrisk konstant. Det er derfor sannsynlig at prosessen med dagens transport er mer kompleks enn enkel tunnelering gjennom en enkelt barriere. Faktisk, naturlige proteiner hvis funksjon innebærer elektronoverføring, trenger ofte å overføre elektroner med høy retnings spesifisitet over store avstander. Slik overføring over lengre avstander innebærer alltid en kjede av kofaktorer, for eksempel redokssentre (22). I analogi med disse redoks-sentrene kan vi vurdere retinal, det π-elektronsystemet som ligger i sentrum av bR, som et mellomliggende på banen av elektronene gjennom proteinet. Hvis, i stedet for å tunnelere gjennom et langt molekyl, prosessen skjer i (minst) to trinn, med en delokalisert elektronveisstasjon 2,3 nm fra hver side, gir estimater som ligner de som er brukt ovenfor, strømmer av ≈10-20 A per 35 nm2 (21) .

for å sjekke denne siste ideen eksperimentelt, forberedte vi og undersøkte veikryss av retinalfrie bR-membraner. For å forberede disse membranene opplyste vi først proteinet blandet med hydroksylamin. Denne reaksjonen fører til å bryte den protonerte Schiff – basebindingen, noe som gir apo-proteinbakteriopsin (BO) og retinaloksim, som forblir festet til membranen (12). Retinaloksim ble deretter fjernet ved å resuspendere apo-membranene i en oppløsning AV BSA, etterfulgt av inkubasjon og sentrifugering. BSA løser konkurransedyktig retinaloxime som er innebygd i membranen. Gjentatte sentrifugevasker fjerner BSA når proteinet har blitt renset for alle kromoforforurensninger(5). Strømmen gjennom (retinal-fri) apo-membran er omtrent tre størrelsesordener lavere enn det som ble observert med native bR membraner (sammenlign Figs. 4 a og 3 A). Strømmen var veldig bråkete og ustabil. Dette resultatet støtter ideen om at strømmen flyter dominant gjennom bR-proteinene, og at retinal fungerer som en strømtransportmediator. Videre kan fotoeffekten observert med de innfødte bR-holdige membranene tilskrives retinal.

Fig. 4.

I-V egenskaper av metall-apo-membran-metall veikryss. (A) Typisk I-V karakteristisk For En Au / apo-membran(netthinnefri)/(APTMS-AlOx–Al) veikryss fremstilt ved vesikelfusjon og målt ved omgivelsesforhold. (B) I–v kurver Av Au/apo-membran(apo-protein bR pluss retinaloksim)/(APTMS–AlOx–Al) kryss fremstilt ved vesikelfusjon og målt ved omgivelsesforhold i mørket og ved belysning ved λ > 550 nm. Ingen fotoeffekt på kryssstrømmen ble observert.

for å sjekke om retinal–protein kovalent binding er en forutsetning for elektrontransport, målte vi apo-membranprøver som inneholdt retinaloksim. Minst en del av retinaloksim vil fortsatt oppta retinal-bindingsstedet som utledet FRA CD-spektroskopi (23). I-V-kurver av slike prøver viste oppførsel som ligner på innfødte bR i form av dagens størrelse, men de viste ikke noe svar på grønt lys som forventet i prøver som mangler absorpsjon i denne regionen (Fig. 4 B). I – v-egenskapene er nærmere lineære enn det vi finner for villtype-prøver, noe som kan indikere en endring av tunneling gap mellom retinal og retinaloxime.For å kaste ytterligere lys på effekten av retinal isomerisering og fotosyklusen på lyseffekten, studerte vi kunstige pigmenter avledet fra 13-cis (3) – låste retinaler (Skjema 1), hvor den kritiske C 13 Innebygd Bilde1c 14 isomerisering er blokkert av en 5-ledd ringstruktur (24, 25). I-V egenskaper som ligner de som er oppnådd med apo-membraner med retinal oksim er funnet for de kunstige pigmentene. Mangelen på fotoeffekt i veikryss laget med apo-membraner er i tråd med fraværet av en fotocyklus i disse prøvene (24, 26), som støtter hypotesen om at forekomst av retinal isomerisering er en forutsetning for lyseffekten. Vi antar at ingen uttalt, elektrisk feltinducert, bR-konformasjonsendring forekommer (dvs. bR vil forbli native-like) i de ≤10 6 V/cm feltene over proteinet som nås i våre eksperimenter. Vi merker at Au – toppelektroden er halvtransparent for grønt lys. For eksempel overfører en Au-film på 55 nm ≈70% ved ≈550 nm (27). En mulig fysisk opprinnelse av fotoeffekten fra nanogap, plan, metall nanostruktur selv, for eksempel ved overflateplasmon-eksitasjon, kan sikkert utelukkes (28). På grunnlag av disse og de ovenfor beskrevne resultatene tilskriver vi photoeffect på kryssstrømmene til 13-cis/all-trans retinal photoisomerization (4) og proteinkonformasjonsendringene som følge av det. Vi merker oss at elektronene i våre eksperimenter stammer fra metallelektroder og passerer gjennom bR fra elektrode til elektrode under påført spenning, med bR som et elektronisk ledningsmedium. I dette henseende er bR forskjellig fra systemer som fotosyntetiske reaksjonssentre, hvor elektronoverføring mellom kofaktorer er fotoinducert.

det er klart fra beregningene og fra for eksempel Det negative resultatet Av Fig. 4 A at mekanismen ikke er (bare) en av direkte tunneling. Det er også usannsynlig å være (utelukkende) en av hopping i lys Av (enkeltmolekylet) resultatene Av Selzer et al. (29). Hvordan kan elektronene krysse proteinet? Våre eksperimentelle resultater tyder tydelig på at retinal kromofor er en nødvendig komponent for ledningsprosessen. Det er velkjent at retinal er koblet til den ekstracellulære siden via Et h-bundet nettverk, som sannsynligvis gir en elektrostatisk skjermet bane for ladetransport. Fordi det også er god kobling mellom retinal og ekstracellulær side i mørket, må denne banen være tilstede uavhengig av belysning. Dens tilstedeværelse kan forklare de høyere enn forventede strømmer som vi måler. Forbindelsen av retinal til cytoplasmatisk overflate er kjent for å være lysaktivert, noe som kan forklare lyseffekten vi observerer. Begge disse forslagene trenger videre utredning.betydningen av ladningsoverføring mellom retinal kromofor og proteinmiljøet for bR i grunntilstanden ble foreslått, basert på teori, Av Sakai et al. (30). Disse forfatterne antydet at kromoforen stabiliseres i bR ved en interaksjon av sine høyeste okkuperte og laveste ubebodde molekylorbitaler med proteinmiljøet. Hvis tilstrekkelig ladning overføres mellom to steder, på grunn av den sterke høyeste okkuperte–laveste ubebodde molekylorbitale interaksjonen, kan den (π-konjugerte) kromoforen betraktes som en en-elektron-redusert/-oksidert art (hvis den oppfører seg som en elektron-akseptor/donor). Den mest sannsynlige kromofor-protein-interaksjonen ble beregnet til å være via det H-bundne nettverket langs den antatte protonveien.Det er også fristende å foreslå at protonkoblet elektrontransport (22, 31) spiller en rolle fordi det er kvasi endimensjonale protonerte vannkjeder i protonkanalen til bR (32, 33) innebygd i faste støttede lipidbilayers, som vil være normalt for de to elektrodene i vårt oppsett (17). Dette forslaget kan forklare en del av forskjellen mellom elektrontransport gjennom bR og gjennom angivelig vannfrie peptider. I lys av en slik situasjon oppstår flere spørsmål.

  1. Hvor mye, om i det hele tatt, kan elektrontransport gjennom bR dra nytte av en innebygd protonkanal?

  2. hvordan vil kromoforen og den mellomliggende proteinstrukturen påvirke frekvensen av langdistanse elektrontransport?

  3. i hvilken grad kan bundet vannmolekyler inne i bR bidra til den elektroniske strømmen?

Muligens kan temperaturavhengige I-V–målinger, selv om disse er langt fra trivielle med dette systemet, kaste lys over disse problemene.

Vi bemerker at, i motsetning til tilfellet for et br-monolag i oppløsning, Er Den Faradaiske fotokurrensen av et tørt br-monolag som stammer fra transmembran protontranslokasjon ubetydelig sammenlignet med de observerte kryssstrømmene fordi protonkilden er begrenset. Vårt funn at alle observerte kryssstrømmer (i mørkt eller under grønt lys) er null, innenfor eksperimentell feil , støtter fraværet av steady-state protontranslokasjon. Det er derfor ingen målbar fotoresponse mellom ca. ±30 mV ved ≈0 V (jfr. ref. 34; enhver ≤15-til 20-mV fotovoltage er i støy av vår måling), noe som indikerer at lysdrevet protontranslokasjon over bR-monolaget som holdes mellom elektrodene, bidrar ubetydelig til steady state-lysstrømmene. Denne konklusjonen ble bekreftet av proton-translokasjonsinduserte bR-fotocurrents i lignende solidstøttede lipidbilayers (typisk 4-8 nA/cm2) (18) som er to til tre størrelsesordener lavere enn kryssstrømmene som vi måler her (≈0.5–5 µ/cm2). Likevel, selv uten direkte forbindelse mellom proton og elektrontransport, bemerker vi at et protein som fra elektrostatikkpunktet (screening) er egnet for protonoverføring, kan godt være i stand til å bruke samme mekanisme for screening for å lette elektrontransport.

Vi kan også sammenligne resultatene våre med tidligere rapporterte fotocurrents gjennom ≈500-nm (8) og ≈100-µ (9) tørre flerlag ved å beregne verdier PER PM monolag (5 nm). En slik normalisering gir verdier av ≈0,01 nA per ENKELT PM-lag per cm2, dvs., noen fire til fem størrelsesordener mindre enn kryssstrømmene som vi måler her (≈0.5 – 5 µ / cm2). Denne dramatiske forskjellen illustrerer vanskeligheten med å tolke de tidligere banebrytende målingene (9) og understreker viktigheten av å bruke så godt definert en konfigurasjon som mulig for elektrontransportmålinger av biologiske systemer. Med slike konfigurasjoner blir det også mulig å foreta målinger som en funksjon av kontrollerte variasjoner av systemet.

Resultater og Diskusjon en suspensjon AV PM-fragmenter inneholdende villtype bR ble fremstilt (12) og rekonstituert med eksogent eggfosfatidylkolin (PC) i vesikler ved en modifikasjon Av Metoden Til Racker (13). For ytterligere å kontrollere egenskapene til proteinmengdeavhengig strømspenning (I-V) ble en annen vesikulær br-suspensjon fremstilt ved bruk av oktyltioglukosid (OTG) som vaskemiddel (14). Monolag av de…

Resultater og Diskusjon en suspensjon AV PM-fragmenter inneholdende villtype bR ble fremstilt (12) og rekonstituert med eksogent eggfosfatidylkolin (PC) i vesikler ved en modifikasjon Av Metoden Til Racker (13). For ytterligere å kontrollere egenskapene til proteinmengdeavhengig strømspenning (I-V) ble en annen vesikulær br-suspensjon fremstilt ved bruk av oktyltioglukosid (OTG) som vaskemiddel (14). Monolag av de…

Legg igjen en kommentar

Din e-postadresse vil ikke bli publisert.