Bacteriorhodopsine (bR) als elektronisch geleidingsmedium: Stroomtransport door bR-bevattende monolagen

resultaten en discussie

een suspensie van deeltjes die wild-type bR bevatten werd bereid (12) en gereconstitueerd met exogene eifosfatidylcholine (PC) in blaasjes door een wijziging van de methode van Racker (13). Om de eigenschappen van eiwit-hoeveelheid-afhankelijke stroomspanning (I–V) verder te controleren, werd een andere vesiculaire br–suspensie bereid met octylthioglucoside (OTG) als detergent (14). Monolagen van de inheemse br-bevattende membranen werden vervolgens bereid door het adsorberen van de blaasjes op een al-substraat (een ≈50-nm dikke laag Al verdampt op kwarts) met een laag natuurlijk aluminiumoxide op het oppervlak (hier weergegeven als AlOx). De aangesloten blaasjes openen dan en smelten, die vast-ondersteunde lipide bilagen vormen. Om de elektrostatische adsorptie van de blaasjes te bevorderen, hebben we eerst het substraatoppervlak gesilaniseerd met (3-aminopropyl)trimethoxysilaan (APTMS) (15), gevolgd door behandeling met 0,1 m HCl, om een positief geladen oppervlak te verkrijgen. Zowel br/PC als bR / OTG vesicles suspensies vertoonden licht-geïnduceerde inwaarts Proton pompen zoals eerder werd gevonden (13, 16). Op basis van deze observatie postuleren we een voorkeursoriëntatie van bR met de cytoplasmatische zijde naar het substraatoppervlak na vesikel fusie om br monolaagmembranen te vormen, consistent met oriëntatie-afhankelijke transmembrane proton translocatie (17).

Fig. 2 A toont een representatief AFM-beeld van een substraat, bedekt met Br-bevattende gesmolten blaasmembranen, bereid door 10 min adsorptie op het substraat. Omdat het moeilijk is om een ideale monolaag (100% dekking) te krijgen, zijn er altijd een aantal monster-vrije scheuren of gaatjes (meestal tientallen nanometers), tussen gesmolten vesikel membranen. Deze scheuren en gaatjes zijn klein genoeg voor de Au pad (0,5 mm diameter) om ze te overbruggen (voor transportmetingen) maar groot genoeg voor onze AFM metingen om diktemetingen mogelijk te maken. Sectie analyse toont de hoogste gemiddelde hoogte kenmerk te zijn ≈5,2 nm, die goed overeenkomt met de dikte van een enkele PM patch, wat wijst op de vorming van een BR monolaag. De paar witte stippen in Fig. 2 A zijn overgebleven afgeplatte blaasjes bovenop de film. Dichtere br monolaag-bevattende membranen (Fig. 2 B) resultaat na ≈20-min adsorptie van de blaasjes op het substraat. Fig. 2 B maakt ook een toevallige meting van de membraan/monolaag dikte (5,1 nm tussen markers) als gevolg van een scheur in het membraan als gevolg van overmatige droging. Langere adsorptietijden (>30 min) leidden tot Meerlagige vorming. Monolagen van membranen met gemodificeerde bR werden bereid met behulp van dezelfde procedures. Alle monsters voor elektrische transportmetingen werden met 20 minuten adsorptie voorbereid en door de AFM gecontroleerd om de monolaagkwaliteit te garanderen. Het is vermeldenswaard dat, in tegenstelling tot oppervlakte-ondersteunde zuivere lipide bilagen, die onstabiel zijn en zullen desintegreren bij het drogen (laat staan drogen onder N2 stroom) als gevolg van verlies van hydrofobe interacties tussen lipiden in droge toestand, de as-prepared PC/bR membranen zijn vrij stabiel (zelfs na milde N2-drogen), zoals blijkt uit AFM beelden. We schrijven dit fenomeen toe aan de hoge negatieve ladingen op bR-oppervlakken, die sterk kunnen interageren met het positief geladen substraatoppervlak en fungeren als een steiger om de lipide bilagen te verstijven. Deze interactie maakt de bilagen voldoende robuust om herhaalde en reproduceerbare elektronentransportstudies in monolaagvorm onder omgevingsomstandigheden en bij kamertemperatuur mogelijk te maken.

Fig. 2.

AFM-beelden van BR-bevattende gesmolten membranen. (Links) representatieve AFM-beelden (2 × 2 µm) van monolagen van gesmolten membranen van BR-bevattende blaasjes, bereid door 10 minuten adsorptie op al/AlOx-substraat, afgeleid met APTMS. (A rechts en B rechts) Lijnscans tonen een gemiddelde hoogte van de sterkste eigenschappen van ≈5,2 nm. De hoogtestang dekt 20 nm. (B Left) een dichter verpakte bR Met een monolaag, bereid door 20 minuten adsorptie van blaasjes op het substraat (1,25- × 1,25-µm beeld). De scheur in het membraan, veroorzaakt door overmatige droging (iets dat zorgvuldig werd vermeden bij de voorbereiding van de monsters die worden gebruikt voor elektrische transportmetingen) toont aan dat de monolaag 5,1 nm dik is (tussen de markers).

I–V-metingen werden uitgevoerd op vlakke verbindingsstructuren in een schone kamer van klasse 10000 bij 293K en 40% Relatieve vochtigheid, waarbij het monster tussen het al / Alox-substraat en de au-contacten werd ingeklemd. Op elk monster werden verschillende kleine Au-pads met een diameter van 0,5 mm door de LOFO-techniek op de monolaag afgezet. Het circuit wordt gecompleteerd door voorzichtig een wolfraamelektrode op de gouden elektrode te plaatsen (11). Het belangrijkste voordeel van het gebruik van de LOFO-techniek om topcontact voor te bereiden, in vergelijking met metaalverdampingdepositie of kwikcontacten, is dat de voorgevormde metalen patches kunnen zweven op en overspannen een aantal kleine gaatjes en scheuren (meestal in tientallen nanometers), waardoor elektrische metingen succesvol. Fig. 3 A vertoont typische I-V-kenmerken van een resulterende metaal/(bR monolaag-in-lipide bilayer) / metaalverbinding over een ± 1-V bias bereik. De i-V-curven werden geregistreerd na een donkere equilibratie, gevolgd door bestraling met groen (λ > 550 nm, 20 mW/cm2) licht. In het donker, 0,75 na stromen bij een 1-V toegepaste bias werd gedetecteerd. Na steady-state verlichting met groen licht, de stroom toeneemt van 0,75 tot 1,7 nA bij een 1-V toegepaste bias. Zodra het groene licht werd geblokkeerd, verviel de stroom gedurende 2-3 minuten tot zijn oorspronkelijke donkere waarde. Mogelijk wordt het lichteffect geassocieerd met de vorming van het fotochemisch geïnduceerde m-tussenproduct dat onder droge monolaagomstandigheden een trager thermisch verval kan hebben dan in membranen in oplossing (18). Het systeem kan tussen deze twee toestanden worden gefietst door afwisselend groen licht en donker aan te passen, wat erop wijst dat het BR-preparaat zijn fotoactiviteit behoudt. Regelapparaten met alleen een aptms monolaag tussen al / AlOx en Au contacten werden altijd kortgesloten met typische junctieweerstanden < 50 Ω, wat aangeeft dat de ALO x lagen dun genoeg zijn voor betrouwbare elektrische metingen.

Fig. 3.

i-V kenmerken van metaal–(bR monolaag) – metaal juncties. A) i-V–krommen van een ae/(wild–type bR)/(APTMS-AlOx-Al) junctie met georiënteerde br-monolaag, bereid door fusie met de blaasjes en gemeten bij omgevingsomstandigheden in het donker, bij belichting bij λ > 550 nm, en aanpassing aan het donker. De pijlen laten zien dat de i–v reacties kunnen worden gefietst tussen de twee staten. Het Au pad gebied was 2,10-3 cm2. (B) Plot van donkere stromen bij een +1,0-V bias spanning voor acht onafhankelijke aansluitingen bereid van bR/PC blaasjes en van bR/OTG blaasjes, respectievelijk.

de cruciale rol die bR speelt bij het produceren van de gemeten transmembraanstromen wordt geïllustreerd door gebruik te maken van een ander monolaagmembraan met een hoger bR-gehalte, dat werd bereid zoals gerapporteerd in ref. 14 door OTG te gebruiken als detergent voor de vorming van BR blaasjes. Deze twee soorten br monolaag (met membranen met verschillende br inhoud bereid uit br/PC of bR / OTG blaasjes) zal worden genoteerd als membraan A of B en aansluiting A of B voor overeenkomstige verbindingen. De typische extinctie (in OD) bij ≈560 nm is ≈0,15 × 10-3 en ≈1,0 × 10-3 voor membraan A en B, respectievelijk. Het bR-gehalte van membraan B (≈6-voudig hoger dan dat van membraan A) is vergelijkbaar met dat van bR in een droge DEELTJESMATERIAALMONOLAAG, gebaseerd op zowel de experimentele absorptie (18) als de waarde, berekend voor een ideale DEELTJESMATERIAALMONOLAAG (≈1 × 10-3 OD bij ≈560 nm). De gemiddelde donkere stromen bij een gegeven toegepaste bias van kruispunten B zijn bijna acht keer zo groot als die bij kruispunten A, d.w.z. zeer nauw evenredig met het bR-gehalte in de membranen (Fig. 3 B). Dit vinden stelt voor dat elektronen hoofdzakelijk via bR door het membraan eerder dan door de lipide bilagen overgaan. Beide knooppunten A en B zijn fotoactief en vertonen, wanneer genormaliseerd naar bR–inhoud, vergelijkbare I-V-kenmerken.

De gemiddelde lichteffecten op de stroom van de knooppunten A en B zijn typisch ≈1 en ≈3 nA bij een 1-V toegepaste bias, respectievelijk. De door licht veroorzaakte verandering in de knooppunt B-stroom is iets lager dan verwacht, gebaseerd op het bR-gehalte van de twee soorten monsters. Het verschil kan te wijten zijn aan verschillen in de fracties van het M-tussenproduct die zich kunnen ophopen in monsters A en B en/of aan verschillen tussen de twee monsters in de foto-geïnduceerde eiwitconformatie, opgelegd door M-vorming.

meetbare stroomstroom door het 5 nm Dikke eiwit is opmerkelijk, in vergelijking met andere vergelijkbare systemen met dezelfde kloof. Bijvoorbeeld, merken we op dat een typische 1-nm-lange peptide ≈12 nA passeert bij 0,5 V (19), vergelijkbaar met die gepasseerd door een enkele 1,2-nm-lange octaan dithiol (20). Alle andere factoren zijn gelijk en uitgaande van een exponentiële afname van (tunnel) stroom met toenemende molecuullengte, levert een stroom op van ≈10-23 A voor een ≈35-nm2 oppervlakte( gelijk aan de oppervlakte van één bR trimer plus lipiden), gebruikmakend van het Simmons model voor directe tunneling (vergelijk sectie 2 en figuur 2 in ref. 21). Op basis van onze optische absorptiegegevens schatten we de dichtheid van bR in onze membranen op ≈109 br trimer per 0,002-cm2 junctie. Deze waarde vertaalt zich in een experimenteel gemeten stroom van 3 × 10-19 A per br trimer, d.w.z., ten minste vier ordes van grootte meer dan wat wordt geschat voor directe tunneling door 5-nm peptiden, alkyls, of een diëlektrisch medium met soortgelijke diëlektrische constante. Het is daarom waarschijnlijk dat het proces van het huidige vervoer complexer is dan het eenvoudig tunnelen door één enkele barrière. Inderdaad, moeten de natuurlijke proteã nen wiens functie elektronenoverdracht impliceert vaak elektronen met hoge directionele specificiteit over grote afstanden overbrengen. Dergelijke overdracht over langere afstanden gaat altijd gepaard met een keten van cofactoren, zoals redoxcentra (22). In analogie met deze redoxcentra, kunnen we netvlies, het π-elektron systeem dat in het centrum van bR, beschouwen als een tussenpersoon op het pad van de elektronen door het eiwit. Als, in plaats van tunneling door een lange molecule, het proces plaatsvindt in (ten minste) twee stappen, met een gedelokaliseerde elektronen weg-station 2,3 nm van elke kant, schattingen vergelijkbaar met die hierboven gebruikt geven stromen van ≈10-20 A per 35 nm2 (21) .

om dit laatste idee experimenteel te controleren, hebben we juncties van retinale-vrije bR-membranen voorbereid en onderzocht. Om deze membranen te bereiden, hebben we eerst het eiwit gemengd met hydroxylamine verlicht. Deze reactie leidt tot het breken van de geprotoneerde Schiff-basisbinding, die apo-eiwitbacteriopsine (BO) en retinaloxime opleveren, die aan het membraan (12) blijft gehecht. Het retinaloxim werd vervolgens verwijderd door de apo-membranen te resuspenderen in een BSA-oplossing, gevolgd door incubatie en centrifugatie. BSA Lost competitief de retinaloxime op die in het membraan is ingebed. Herhaalde centrifugespoelingen verwijderen BSA zodra het eiwit is gezuiverd van alle chromofore contaminanten (5). De huidige stroom door het (retinale-vrije) apo-membraan is ongeveer drie ordes van grootte lager dan werd waargenomen met inheemse bR-membranen (vergelijk Fig ‘ s. 4 A en 3 A). De stroming was erg luidruchtig en onstabiel. Dit resultaat ondersteunt het idee dat de stroom dominant door de bR-eiwitten stroomt en dat het netvlies dient als een huidige transportmediator. Bovendien kan het foto-effect waargenomen met de inheemse br-bevattende membranen worden toegeschreven aan het netvlies.

Fig. 4.

i-V kenmerken van metaal-apo–membraan-metaalverbindingen. (A) typisch I–V-kenmerk van een au/apo-membraan(retinale–vrije)/(APTMS–AlOx-Al) junctie bereid door vesikel fusie en gemeten onder omgevingsomstandigheden. B) I-V-krommen van Au/apo–membraan (apo–proteïne bR plus retinaloxime)/(APTMS-AlOx-Al) junctie, bereid door vesikelfusie en gemeten bij omgevingsomstandigheden in het donker en bij belichting bij λ > 550 nm. Er werd geen fotoeffect op de aansluitstroom waargenomen.

om te controleren of de retinale–eiwitcovalente binding een vereiste is voor elektronentransport, hebben we apo-membraanmonsters met retinaloxim gemeten. Ten minste een deel van de retinaloxim zal nog steeds de retinale bindingsplaats bezetten, zoals afgeleid uit CD-spectroscopie (23). I-V-krommen van dergelijke steekproeven vertoonden gedrag gelijkaardig aan dat van native bR In termen van huidige grootte, maar zij toonden geen reactie op groen licht zoals verwacht in steekproeven die absorptie in dit gebied ontberen (Fig. 4 B). De i-V kenmerken zijn dichter bij lineair dan wat we vinden voor wild-type monsters, die kunnen wijzen op een verandering van tunneling kloof tussen retinale en retinaloxim.

om meer licht te werpen op het effect van retinale isomerisatie en de fotocycle op het lichteffect, bestudeerden we kunstmatige pigmenten afgeleid van 13-cis (3)-vergrendelde retinalen (Schema 1), waar de kritische C 13 Embedded Image1C 14 isomerisatie wordt geblokkeerd door een 5-membered ringstructuur (24, 25). I-V-eigenschappen die vergelijkbaar zijn met die verkregen met apo-membranen met retinale oxime worden gevonden voor deze kunstmatige pigmenten. Het ontbreken van fotoeffect in verbindingen met apo-membranen is in overeenstemming met de afwezigheid van een fotocycle in deze monsters (24, 26), wat de hypothese ondersteunt dat het optreden van retinale isomerisatie een voorwaarde is voor het lichteffect. We gaan ervan uit dat er geen uitgesproken, elektrisch-veld-geïnduceerde, br conformationele verandering optreedt (d.w.z., bR zal inheems-achtig blijven) in de ≤10 6 V/cm velden over het eiwit dat in onze experimenten worden bereikt. We merken op dat de au-topelektrode semitransparant is voor groen licht. Bijvoorbeeld, een 55-nm Au film geeft ≈70% bij ≈550 nm (27). Een mogelijke fysische oorsprong van het fotoeffect uit de nanogap, planaire, metaalnanostructuur zelf, bijvoorbeeld door oppervlakte plasmon excitatie, kan veilig worden uitgesloten (28). Op basis van deze en de hierboven beschreven resultaten schrijven we het fotoeffect op de junctiestromen toe aan de 13-cis/all-trans retinale fotoisomerisatie (4) en de proteïne conformationele veranderingen die daaruit voortvloeien. We merken op dat in onze experimenten de elektronen afkomstig zijn van metaalelektroden en door bR van elektrode naar elektrode gaan onder toegepaste spanning, waarbij bR fungeert als een elektronisch geleidingsmedium. In dit opzicht verschilt bR van systemen zoals de fotosynthetische reactiecentra, waarin elektronenoverdracht tussen cofactoren wordt photoinduced.

Het is duidelijk uit de berekeningen en uit bijvoorbeeld het negatieve resultaat van Fig. 4 A dat het mechanisme niet (alleen) een van directe tunneling is. Het is ook onwaarschijnlijk dat het (uitsluitend) een van hopping is gezien de (enkelvoudige molecule) resultaten van het werk van Selzer et al. (29). Hoe kunnen de elektronen dan het eiwit kruisen? Onze experimentele resultaten geven duidelijk aan dat het netvlies chromophore een noodzakelijke component voor het geleidingsproces is. Het is bekend dat het netvlies via een H-gebonden netwerk met de extracellulaire kant is verbonden, dat waarschijnlijk een elektrostatisch gescreend pad voor ladingstransport biedt. Omdat er ook in het donker een goede koppeling is tussen het netvlies en de extracellulaire zijde, moet dit pad aanwezig zijn ongeacht de verlichting. Zijn aanwezigheid kan de hoger dan verwachte stromingen verklaren die we meten. De verbinding van het netvlies met het cytoplasmatische oppervlak is bekend dat het licht geactiveerd is, wat het lichteffect kan verklaren dat we waarnemen. Beide voorstellen moeten nader worden onderzocht.

Het belang van ladingsoverdracht tussen de chromofoor van het netvlies en de eiwitomgeving voor bR in zijn grondtoestand werd op basis van theorie gesuggereerd door Sakai et al. (30). Deze auteurs veronderstelden dat chromophore in bR door een interactie van zijn hoogste bezette en laagste onbezette moleculaire orbitals met het eiwitmilieu wordt gestabiliseerd. Als voldoende lading tussen twee plaatsen wordt overgebracht, wegens de sterke hoogst bezette-laagste onbezette moleculaire orbitale interactie, kan de (π-geconjugeerde) chromophore als één-elektron-verminderde/-geoxideerde species worden gezien (als het zich als elektronacceptor/donor gedraagt). De meest waarschijnlijke chromophore-eiwitinteractie werd berekend om via het H-gebonden netwerk langs de veronderstelde protonweg te zijn.

Het is ook verleidelijk om te suggereren dat proton-gekoppeld elektronentransport (22, 31) een rol speelt omdat er quasi eendimensionale geprotoneerde waterketens in het protonkanaal van bR (32, 33) zijn ingebed in vaste ondersteunde lipidebilagen, die normaal zijn voor de twee elektroden in onze opstelling (17). Deze suggestie kan een deel van het verschil tussen elektronentransport door bR en door zogenaamd watervrije peptides verklaren. In het licht van een dergelijke situatie doen zich verschillende vragen voor.

  1. In hoeverre kan elektronentransport door bR profiteren van een ingebouwd protonkanaal?

  2. Hoe zullen de chromofoor en de tussenliggende eiwitstructuur de snelheid van elektronentransport over lange afstand beïnvloeden?

  3. in hoeverre kunnen gebonden watermoleculen in bR bijdragen aan de elektronische stroom?

mogelijk kunnen temperatuurafhankelijke I-V–metingen, hoewel deze bij dit systeem verre van triviaal zijn, licht werpen op deze problemen.

wij merken op dat, in tegenstelling tot het geval van een BR-monolaag in oplossing, de Faradaïsche fotocurrent van een droge bR-monolaag afkomstig van transmembrane proton translocatie verwaarloosbaar is in vergelijking met de waargenomen junctiestromen omdat de protonbron beperkt is. Onze bevinding dat alle waargenomen junctiestromen (in donker of onder groen licht) nul zijn, binnen experimentele fout , ondersteunt de afwezigheid van steady-state proton translocatie. Er is dus geen meetbare fotorespons tussen ongeveer ±30 mV bij ≈0 V (cf. ref. 34; elke ≤15-tot 20-mV fotovoltage is in het geluid van onze meting), wat aangeeft dat licht-aangedreven proton translocatie over de BR monolaag gehouden tussen de elektroden verwaarloosbaar bijdraagt aan de steady-state lichtstromen. Deze conclusie werd bevestigd door de proton-translocatie-geïnduceerde bR-fotocurrenten in vergelijkbare vaste lipidebilagen (typisch 4-8 nA/cm2) (18) die twee tot drie ordes van grootte lager zijn dan de junctiestromen die we hier meten (≈0,5–5 µA/cm2). Toch, zelfs zonder enige directe verbinding tussen proton en elektronentransport, merken we op dat een eiwit dat, vanaf het punt van Elektrostatica (screening), geschikt is voor proton transfer, heel goed in staat kan zijn om hetzelfde mechanisme van screening te gebruiken om elektronentransport te vergemakkelijken.

We kunnen onze resultaten ook vergelijken met de eerder gerapporteerde fotocurrenten via de ≈500-nm (8) en ≈100-µm (9) droge meerlagen door waarden per PM monolaag (5 nm) te berekenen. Dergelijke normalisatie levert waarden op van ≈0,01 nA per enkele PM laag per cm2, d.w.z. zo ‘ n vier tot vijf ordes van grootte minder dan de knooppuntstromen die we hier meten (≈0,5–5 µA/cm2). Dit dramatische verschil illustreert de moeilijkheid om de vroegere, baanbrekende metingen te interpreteren (9) en benadrukt het belang van het gebruik van een zo goed mogelijke configuratie voor elektronentransportmetingen van biologische systemen. Met dergelijke configuraties wordt het dan ook mogelijk om metingen te doen als functie van gecontroleerde variaties van het systeem.

resultaten en discussie een suspensie van deeltjes die wild-type bR bevatten werd bereid (12) en gereconstitueerd met exogene eifosfatidylcholine (PC) in blaasjes door een wijziging van de methode van Racker (13). Om de eigenschappen van eiwit-hoeveelheid-afhankelijke stroomspanning (I–V) verder te controleren, werd een andere vesiculaire br–suspensie bereid met octylthioglucoside (OTG) als detergent (14). Monolagen van…

resultaten en discussie een suspensie van deeltjes die wild-type bR bevatten werd bereid (12) en gereconstitueerd met exogene eifosfatidylcholine (PC) in blaasjes door een wijziging van de methode van Racker (13). Om de eigenschappen van eiwit-hoeveelheid-afhankelijke stroomspanning (I–V) verder te controleren, werd een andere vesiculaire br–suspensie bereid met octylthioglucoside (OTG) als detergent (14). Monolagen van…

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.