Bacteriorhodopsina (bR) ca mediu de conducere electronică: transportul curentului prin monostraturi care conțin bR

rezultate și discuții

a fost preparată o suspensie de fragmente PM care conțin br de tip sălbatic (12) și reconstituită cu fosfatidilcolină de ou exogenă (PC) în vezicule printr-o modificare a metodei Racker (13). Pentru a verifica în continuare caracteristicile curentului-tensiune (I-V) dependent de cantitatea de proteine, a fost preparată o altă suspensie veziculară bR utilizând octiltioglucozidă (OTG) ca detergent (14). Monostraturile membranelor native care conțin bR au fost apoi preparate prin adsorbția veziculelor pe un substrat Al (o peliculă de al cu grosime de 50 nm de 50 nm evaporată pe cuarț) cu un strat de oxid de aluminiu natural pe suprafața sa (reprezentat aici ca AlOx). Veziculele atașate se deschid și fuzionează, formând bistraturi lipidice susținute solid. Pentru a promova adsorbția electrostatică a veziculelor, am silanizat mai întâi suprafața substratului cu (3-aminopropil)trimetoxisilan (APTMS) (15), urmată de tratament cu 0,1 m HCl, pentru a obține o suprafață încărcată pozitiv. Ambele suspensii de vezicule br / PC sau bR / OTG au arătat o pompare de protoni indusă de lumină, așa cum s-a găsit anterior (13, 16). Pe baza acestei observații, postulăm o orientare preferențială a bR CU PARTEA citoplasmatică orientată spre suprafața substratului după fuziunea veziculelor pentru a forma Membrane monostrat bR, în concordanță cu translocarea protonului transmembranar dependent de orientare (17).

Fig. 2 A prezintă o imagine reprezentativă AFM a unui substrat, acoperit de membrane veziculare topite care conțin bR, preparate prin adsorbție de 10 minute pe substrat. Deoarece este dificil să obțineți un monostrat ideal (acoperire 100%), există întotdeauna unele fisuri sau găuri fără probe (de obicei zeci de nanometri), între membranele veziculelor topite. Aceste fisuri și găuri sunt suficient de mici pentru ca tamponul Au (diametrul de 0,5 mm) să le acopere (pentru măsurarea transportului), dar suficient de mari pentru măsurătorile noastre AFM pentru a face posibile măsurătorile de grosime. Analiza secțiunii arată că cea mai mare caracteristică de înălțime medie este de 5,2 nm, care este în concordanță cu grosimea unui singur plasture PM, indicând formarea unui monostrat bR. Cele câteva puncte albe din Fig. 2 A sunt vezicule aplatizate rămase deasupra filmului. Membrane care conțin monostrat br mai dens (Fig. 2 B)rezultat după 20-min de adsorbție a veziculelor pe substrat. Fig. 2 B permite, de asemenea, o măsurare fortuită a grosimii membranei/monostratului (5,1 nm între markeri) din cauza unei fisuri în membrană ca urmare a uscării excesive. Timpii de adsorbție mai lungi (>30 min) au dus la formarea mai multor straturi. Monostraturile membranelor cu BR modificate au fost preparate prin utilizarea acelorași proceduri. Toate probele pentru măsurătorile de transport electric au fost pregătite cu 20 min de adsorbție și verificate de AFM pentru a asigura calitatea monostratului. Este demn de menționat faptul că, spre deosebire de bistraturile lipidice pure susținute la suprafață, care sunt instabile și se vor dezintegra la uscare (cu atât mai puțin uscarea sub fluxul N2) din cauza pierderii interacțiunilor hidrofobe dintre lipide în stare uscată, membranele PC/bR preparate sunt destul de stabile (chiar și după uscarea ușoară a N2), așa cum arată imaginile AFM. Atribuim acest fenomen sarcinilor negative ridicate pe suprafețele bR, care pot interacționa puternic cu suprafața substratului încărcată pozitiv și pot acționa ca o schelă pentru rigidizarea bistraturilor lipidice. Această interacțiune face bistraturile suficient de robuste pentru a permite studii repetate și reproductibile de transport de electroni în mod monostrat în condiții ambientale și la temperatura camerei.

Fig. 2.

imagini AFM ale membranelor topite care conțin bR. (A stânga) imagini reprezentative AFM (2 x,2 x,q) ale monostraturilor de membrane topite ale veziculelor conținând bR, preparate prin adsorbție 10-min pe substrat Al/AlOx, derivatizate cu APTMS. (A dreapta și B dreapta) scanări de linie care arată o înălțime medie a celor mai puternice caracteristici ale 5.2 nm de la centimetrii. Bara de înălțime acoperă 20 nm. (B stânga) un bR mai dens ambalat care conține un monostrat, preparat prin adsorbția 20-min a veziculelor pe substrat (imagine 1,25 – 1,25-1,25-1,25-XNUMXm). Fisura din membrană, indusă de uscarea excesivă (lucru care a fost evitat cu atenție la prepararea probelor utilizate pentru măsurătorile de transport electric) arată că monostratul are o grosime de 5,1 nm (între markeri).

măsurătorile I–v au fost efectuate pe structuri de joncțiune plană într-o cameră curată clasa-10000 la 293k și 40% umiditate relativă, eșantionul fiind intercalat între substratul Al / AlOx și contactele ua. Pe fiecare probă, mai multe tampoane Au mici, cu diametrul de 0,5 mm, au fost depuse pe monostrat prin tehnica LOFO. Circuitul este completat prin plasarea ușoară a unui electrod de tungsten pe electrodul de aur (11). Principalul avantaj al utilizării tehnicii LOFO pentru a pregăti contactul superior, în comparație cu depunerea prin evaporare a metalelor sau contactele cu mercur, este că plasturile metalice preformate pot pluti și se pot întinde pe niște găuri mici și fisuri (de obicei în zeci de nanometri), făcând măsurătorile electrice cu succes. Fig. 3 A prezintă caracteristicile tipice i-v ale unui metal rezultat/(br monostrat-în-strat lipidic bistrat)/joncțiune metalică pe un interval de polarizare de 1-V de la sută. Curbele I-V au fost înregistrate după echilibrarea întunecată urmată de iradierea cu lumină verde (inqut > 550 nm, 20 mW/cm2). În întuneric, au fost detectate fluxuri de 0,75 nA la o prejudecată aplicată de 1-V. După iluminarea la starea de echilibru cu lumină verde, curentul crește de la 0,75 la 1,7 nA la o prejudecată aplicată de 1-V. Odată ce lumina verde a fost blocată, curentul s-a degradat peste 2-3 minute la valoarea sa întunecată inițială. Posibil, efectul de lumină este asociat cu formarea intermediarului m indus fotochimic care poate avea o degradare termică mai lentă în condiții de monostrat uscat decât în membranele în soluție (18). Sistemul poate fi ciclat între aceste două stări prin alternarea luminii verzi și a adaptării întunecate, indicând faptul că preparatul bR își păstrează fotoactivitatea. Dispozitivele de Control cu doar un monostrat APTMS încorporat între contactele Al/AlOx și Au au fost întotdeauna scurtcircuitate cu rezistențe tipice de joncțiune <50 XV, indicând faptul că straturile AlO x sunt suficient de subțiri pentru măsurători electrice fiabile.

Fig. 3.

caracteristicile i–V ale joncțiunilor metalice–(bR monostrat)–metalice. (A) curbele I–V ale unei joncțiuni Au/(BR de tip sălbatic)/(APTMS-AlOx–Al) care conține monostrat BR orientat, preparat prin fuziunea veziculelor și măsurat în condiții ambientale în întuneric, la iluminare la > 550 nm și adaptare la întuneric. Săgețile arată că răspunsurile I–V pot fi ciclate între cele două stări. Suprafața au pad a fost de 2,10-3 cm2. (B) graficul curenților întunecați la o tensiune de polarizare de +1,0-V pentru opt joncțiuni independente preparate din vezicule bR/PC și, respectiv, din vezicule bR/OTG.

rolul crucial pe care îl joacă bR în producerea curenților transmembranari măsurați este ilustrat prin utilizarea unei alte membrane monostrat cu conținut mai mare de bR, care a fost preparată conform raportului ref. 14 prin utilizarea OTG ca detergent pentru formarea veziculelor bR. Aceste două tipuri de monostrat bR (Care conțin membrane cu conținut bR diferit preparat din vezicule bR/PC sau bR/OTG) vor fi notate ca membrană a sau B și joncțiune a sau B pentru joncțiunile corespunzătoare. Absorbantele tipice (in OD) la 560 nm sunt 0.15 00-3 si 1.0 10-3 pentru membrana a si respectiv B. Conținutul de BR al membranei B (de 6 ori mai mare decât cel al membranei a) este similar cu cel al bR într-un monostrat PM uscat, bazat atât pe absorbanța experimentală (18), cât și pe valoarea calculată pentru un monostrat PM ideal (de la 1 la 10-3 od la 560 nm). Curenții întunecați medii la o prejudecată aplicată dată a joncțiunilor B sunt de aproape opt ori mai mari decât cele găsite cu joncțiunile A, adică foarte strâns proporționale cu conținutul bR din membrane (Fig. 3 B). Această constatare sugerează că electronii trec în principal prin bR prin membrană, mai degrabă decât prin bistraturile lipidice. Ambele joncțiuni a și B sunt fotoactive și, atunci când sunt normalizate la conținutul bR, prezintă caracteristici I–v similare.

efectele medii ale luminii asupra fluxului de curent al joncțiunilor a și B sunt de obicei de la 1 la 1-V, respectiv de la 1 la 3 nA. Schimbarea indusă de lumină a curentului de joncțiune B este ceva mai mică decât se aștepta, pe baza conținutului bR al celor două tipuri de probe. Diferența s-ar putea datora diferențelor în fracțiile intermediarului M care se pot acumula în probele a și B și/sau cu diferențe între cele două probe în modificarea conformației proteinei fotoinduse, impusă de formarea M.

fluxul de curent măsurabil prin proteina groasă de 5 nm este remarcabil, în comparație cu alte sisteme similare cu același decalaj. De exemplu, observăm că o peptidă tipică lungă de 1 nm va trece de 12 nA la 0,5 v (19), similară cu cea trecută de un singur ditiol octanic lung de 1,2 nm (20). Toți ceilalți factori fiind egali și presupunând o scădere exponențială a curentului (tunel) cu creșterea lungimii moleculei, produce un curent de 10-23 a pentru o zonă de 35-nm2 a la 35-nm2 (echivalent cu aria unui trimer bR plus lipide), folosind modelul Simmons pentru tunelare directă (comparați Secțiunea 2 și figura 2 din ref. 21). Pe baza datelor noastre de absorbție optică, estimăm că densitatea bR în membranele noastre este de 109 br trimer la 0,002-cm2 joncțiune. Această valoare se traduce printr-un curent măsurat experimental de 3 XTX 10-19 A per br trimer, adică., cu cel puțin patru ordine de mărime mai mult decât ceea ce se estimează pentru tunelarea directă prin peptide de 5 nm, alchili sau un mediu dielectric cu constantă dielectrică similară. Prin urmare, este probabil ca procesul de transport actual să fie mai complex decât tunelarea simplă printr-o singură barieră. Într-adevăr, proteinele naturale a căror funcție implică transferul de electroni trebuie adesea să transfere electroni cu specificitate direcțională ridicată pe distanțe mari. Un astfel de transfer pe distanțe mai lungi implică întotdeauna un lanț de cofactori, cum ar fi centrele redox (22). În analogie cu acești centri redox, putem considera retina, sistemul de electroni-electron care se află în centrul bR, ca intermediar pe calea electronilor prin proteină. Dacă, în loc să se tuneleze printr-o moleculă lungă, procesul are loc în (cel puțin) două etape, cu o stație de cale electronică delocalizată la 2,3 nm de fiecare parte, estimări similare cu cele utilizate mai sus dau curenți de 10-20 a la 35 nm2 (21) . pentru a verifica experimental această ultimă idee, am pregătit și examinat joncțiunile membranelor br fără retină. Pentru a pregăti aceste membrane, am iluminat mai întâi proteina amestecată cu hidroxilamină. Această reacție duce la ruperea legăturii de bază Schiff protonată, producând bacterioopsina apo-proteică (BO) și retinaloxima, care rămâne atașată la membrană (12). Retinaloxima a fost apoi îndepărtată prin omogenizarea apo-membranelor într-o soluție de BSA, urmată de incubare și centrifugare. BSA solubilizează competitiv retinaloxima care este încorporată în membrană. Spălările repetate prin centrifugă elimină BSA odată ce proteina a fost purificată de toți contaminanții cromofori (5). Fluxul de curent prin apo-membrana (fără retină) este cu aproximativ trei ordine de mărime mai mic decât s-a observat la membranele br native (comparați Fig. 4 A și 3 A). Curentul era foarte zgomotos și instabil. Acest rezultat susține ideea că curentul curge dominant prin proteinele bR și că retina servește ca mediator de transport curent. Mai mult, efectul foto observat cu membranele native care conțin bR poate fi atribuit retinei.

Fig. 4.

caracteristicile i–V ale joncțiunilor metal–apo-membrană–metal. (A) Caracteristica tipică i–V a unei joncțiuni Au/apo-membrană(fără retină)/(APTMS-AlOx–Al) preparată prin fuziunea veziculelor și măsurată în condiții ambientale. (B) curbele I–V ale joncțiunii ua/apo-membrană(apo-proteină bR plus retinaloximă)/(APTMS–Alox–Al) preparate prin fuziunea veziculelor și măsurate în condiții ambientale în întuneric și la iluminare la > 550 nm. Nu a fost observat niciun efect fotoefect asupra curentului de joncțiune.

pentru a verifica dacă legătura covalentă retiniană–proteină este o condiție prealabilă pentru transportul electronilor, am măsurat probe de apo-membrană care conțin retinaloximă. Cel puțin o parte din retinaloximă va ocupa în continuare situsul de legare a retinei, așa cum se deduce din spectroscopia CD (23). Curbele I-V ale unor astfel de probe au prezentat un comportament similar cu cel al br nativ în ceea ce privește magnitudinea actuală, dar nu au prezentat niciun răspuns la lumina verde așa cum era de așteptat în probele lipsite de absorbție în această regiune (Fig. 4 B). Caracteristicile I-V sunt mai aproape de liniare decât ceea ce găsim pentru probele de tip sălbatic, ceea ce poate indica o schimbare a decalajului de tunel între retină și retinaloximă.

pentru a face mai multă lumină asupra efectului izomerizării retinei și a fotociclului asupra efectului de lumină, am studiat pigmenții artificiali derivați din retinalele blocate 13-cis (3) (Schema 1), unde imaginea critică C 13 imagine încorporată 1C 14 izomerizarea este blocată de o structură inelară cu 5 membri (24, 25). Caracteristicile I-V similare cu cele obținute cu apo-membrane cu oximă retiniană se găsesc pentru acei pigmenți artificiali. Lipsa fotoefectului în joncțiunile realizate cu apo-membrane este în concordanță cu absența unui fotociclu în aceste probe (24, 26), susținând ipoteza că apariția izomerizării retinei este o condiție prealabilă pentru efectul de lumină. Presupunem că nu apare nicio schimbare conformațională br pronunțată, indusă de câmpul electric (adică bR va rămâne nativ) în câmpurile de 10 6 V/cm de-a lungul proteinei la care se ajunge în experimentele noastre. Observăm că electrodul superior Au este semitransparent pentru lumina verde. De exemplu, un film UA de 55 nm transmite 70% la 750 nm (27). O posibilă origine fizică a fotoefectului din nanostructura metalică nanogap, plană, în sine, de exemplu prin excitația plasmonului de suprafață, poate fi exclusă în siguranță (28). Pe baza acestora și a rezultatelor descrise mai sus, atribuim fotoefectul asupra curenților de joncțiune fotoizomerizării retiniene 13-cis/all-trans (4) și modificărilor conformaționale ale proteinelor care rezultă din aceasta. Observăm că în experimentele noastre electronii provin de la electrozi metalici și trec prin bR De la electrod la electrod sub tensiune aplicată, bR acționând ca un mediu de conducere electronică. În acest sens, bR diferă de sisteme precum centrele de reacție fotosintetică, în care transferul de electroni între cofactori este fotoindus.

este clar din calcule și din, de exemplu, rezultatul negativ al Fig. 4 a că mecanismul nu este (numai) unul de tunelare directă. De asemenea, este puțin probabil să fie (exclusiv) unul dintre salturi, având în vedere rezultatele (o singură moleculă) ale lucrării lui Selzer și colab. (29). Cum pot atunci electronii să traverseze proteina? Rezultatele noastre experimentale indică în mod clar că cromoforul retinian este o componentă necesară pentru procesul de conducere. Este bine cunoscut faptul că retina este conectată la partea extracelulară printr-o rețea legată de H, care oferă probabil o cale ecranată electrostatic pentru transportul încărcăturii. Deoarece există, de asemenea, o bună cuplare între partea retiniană și cea extracelulară în întuneric, această cale trebuie să fie prezentă indiferent de iluminare. Prezența sa poate explica curenții mai mari decât se așteptau pe care îi măsurăm. Conexiunea retinei la suprafața citoplasmatică este cunoscută a fi activată de lumină, ceea ce poate explica efectul de lumină pe care îl observăm. Ambele sugestii necesită investigații suplimentare.

importanța transferului de sarcină între cromoforul retinian și mediul proteic pentru bR În starea sa fundamentală a fost sugerată, pe baza teoriei, de Sakai și colab. (30). Acești autori au emis ipoteza că cromoforul este stabilizat în bR printr-o interacțiune a celor mai mari orbitali moleculari ocupați și cei mai mici neocupați cu mediul proteic. Dacă se transferă o sarcină suficientă între două site–uri, datorită interacțiunii orbitale moleculare neocupate cu cea mai mare ocupare-cea mai mică, cromoforul (conjugat cu un singur electron) poate fi privit ca o specie redusă/oxidată cu un singur electron (dacă se comportă ca un acceptor/donator de electroni). Cea mai probabilă interacțiune cromofor–proteină a fost calculată prin intermediul rețelei legate de H de-a lungul căii protonice presupuse.

de asemenea, este tentant să sugerăm că transportul de electroni cuplat cu protoni (22, 31) joacă un rol, deoarece există lanțuri de apă protonate cvasi-unidimensionale în canalul de protoni al bR (32, 33) încorporate în bistraturi lipidice solide susținute, ceea ce va fi normal pentru cei doi electrozi din configurația noastră (17). Această sugestie poate explica o parte din diferența dintre transportul electronilor prin bR și prin peptide presupuse fără apă. Având în vedere o astfel de situație apar mai multe întrebări.

  1. cât de mult, dacă este deloc, poate transportul electronilor prin bR să beneficieze de un canal de protoni încorporat?

  2. cum vor afecta cromoforul și structura proteică intermediară rata transportului de electroni pe distanțe lungi?

  3. în ce măsură moleculele de apă legate din interiorul bR pot contribui la curentul electronic?

posibil, măsurătorile i-V dependente de temperatură, deși acestea sunt departe de a fi banale cu acest sistem, pot arunca lumină asupra acestor probleme.

observăm că, spre deosebire de cazul unui monostrat bR în soluție, fotocurentul Faradaic al unui monostrat br uscat provenit din translocarea protonului transmembranar este neglijabil în comparație cu curenții de joncțiune observați, deoarece sursa de protoni este limitată. Constatarea noastră că toți curenții de joncțiune observați (în întuneric sau sub lumină verde) sunt zero, în cadrul erorii experimentale , susține absența translocării protonului la starea de echilibru. Prin urmare, nu există un răspuns fotoresponsabil măsurabil între aproximativ 30 MV la 0 v (cf. arbitru. 34; orice fotovoltaj de 15 până la 20 mv de la o sută la sută se află în zgomotul măsurătorii noastre), indicând faptul că translocarea protonului condus de lumină pe monostratul bR ținut între electrozi contribuie neglijent la curenții de lumină la starea de echilibru. Această concluzie a fost confirmată de fotocurenții bR induși de protoni-translocație în bistraturi lipidice similare cu suport solid (de obicei 4-8 nA/cm2) (18) care sunt cu două până la trei ordine de mărime mai mici decât curenții de joncțiune pe care îi măsurăm aici (0,5-5 INQUA/cm2). Totuși, chiar și fără nicio legătură directă între transportul de protoni și electroni, observăm că o proteină care, din punctul de electrostatică (screening), este potrivită pentru transferul de protoni, poate fi capabilă să utilizeze același mecanism de screening pentru a facilita transportul electronilor.

putem compara, de asemenea, rezultatele noastre cu fotocurenții raportați anterior prin multistraturile uscate de 500 nm (8) și 100 nm (9) de 5 nm prin calcularea valorilor pe PM monostrat (5 nm). O astfel de normalizare produce valori de 0,01 na pe un singur strat PM pe cm2, adică., cu aproximativ patru până la cinci ordine de mărime mai mici decât curenții de joncțiune pe care îi măsurăm aici (0,5–5 0,2). Această diferență dramatică ilustrează dificultatea interpretării măsurătorilor anterioare, de pionierat (9) și subliniază importanța utilizării unei configurații cât mai bine definite pentru măsurătorile de transport de electroni ale sistemelor biologice. Cu astfel de configurații, devine posibilă și efectuarea măsurătorilor în funcție de variațiile controlate ale sistemului.

rezultate și discuții a fost preparată o suspensie de fragmente PM care conțin br de tip sălbatic (12) și reconstituită cu fosfatidilcolină de ou exogenă (PC) în vezicule printr-o modificare a metodei Racker (13). Pentru a verifica în continuare caracteristicile curentului-tensiune (I-V) dependent de cantitatea de proteine, a fost preparată o altă suspensie veziculară bR…

rezultate și discuții a fost preparată o suspensie de fragmente PM care conțin br de tip sălbatic (12) și reconstituită cu fosfatidilcolină de ou exogenă (PC) în vezicule printr-o modificare a metodei Racker (13). Pentru a verifica în continuare caracteristicile curentului-tensiune (I-V) dependent de cantitatea de proteine, a fost preparată o altă suspensie veziculară bR…

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.