Bakteriorhodopsin (bR) som ett elektroniskt ledningsmedium: Strömtransport genom bR-innehållande monolager

resultat och diskussion

en suspension av PM-fragment innehållande vildtyp bR bereddes (12) och rekonstituerades med exogen äggfosfatidylkolin (PC) i vesiklar genom en modifiering av Racker-metoden (13). För att ytterligare kontrollera proteinmängdsberoende strömspänningsegenskaper (i-V) framställdes en annan vesikulär bR-suspension med användning av oktyltioglukosid (OTG) som tvättmedel (14). Monolager av de infödda bR-innehållande membranen framställdes sedan genom adsorbering av vesiklarna på ett Al-substrat (en 50 nm tjock film av al avdunstad på kvarts) med ett lager av naturlig aluminiumoxid på dess yta (representerad här som AlOx). De bifogade vesiklarna öppnar sedan och smälter och bildar faststödda lipidbilayers. För att främja elektrostatisk adsorption av vesiklarna silaniserade vi först substratytan med (3-aminopropyl)trimetoxisilan (Aptm) (15), följt av behandling med 0,1 M HCl, för att erhålla en positivt laddad yta. Både bR / PC eller bR / OTG vesikelsuspensioner visade ljusinducerad inre protonpumpning som hittades tidigare (13, 16). Baserat på denna observation postulerar vi en preferensorientering av bR med den cytoplasmiska sidan vänd mot substratytan efter vesikelfusion för att bilda bR-monoskiktsmembran, i överensstämmelse med orienteringsberoende transmembranprotontranslokation (17).

Fig. 2 A visar en representativ AFM-bild av ett substrat, täckt av bR-innehållande smält vesikelmembran, framställd genom 10-min adsorption på substratet. Eftersom det är svårt att få ett idealiskt monolager (100% täckning) finns det alltid några provfria sprickor eller hål (vanligtvis tiotals nanometer) mellan smälta vesikelmembran. Dessa sprickor och pinhål är små nog för Au-dynan (0,5 mm diameter) för att överbrygga dem (för transportmätning) men tillräckligt stora för våra AFM-mätningar för att göra tjockleksmätningar möjliga. Sektionsanalys visar den högsta genomsnittliga höjdfunktionen för att vara 5,2 nm, vilket överensstämmer väl med tjockleken på en enda PM-lapp, vilket indikerar bildandet av ett bR-monolager. De få vita prickarna i Fig. 2 A är överplattade vesiklar på toppen av filmen. Tätare bR-monolagerinnehållande membran (Fig. 2 B) resultat efter 20-min adsorption av blåsorna på substratet. Fig. 2 B möjliggör också en slumpmässig mätning av membran/monoskikttjocklek (5,1 nm mellan markörer) på grund av en spricka i membranet som ett resultat av överdriven torkning. Längre adsorptionstider (>30 min) ledde till flerskiktsbildning. Monolager av membran med modifierad bR framställdes genom användning av samma procedurer. Alla prover för elektriska transportmätningar bereddes med 20 min adsorption och kontrollerades av AFM för att säkerställa monoskiktskvalitet. Det är värt att nämna att, till skillnad från ytstödda rena lipidbilayers, som är instabila och kommer att sönderfalla vid torkning (än mindre torkning under N2-flöde) på grund av förlust av hydrofoba interaktioner mellan lipider i torrt tillstånd, är de som beredda PC/bR-membranen ganska stabila (även efter mild N2-torkning), vilket avslöjas av AFM-bilder. Vi tillskriver detta fenomen till de höga negativa laddningarna på bR-ytor, som kan interagera starkt med den positivt laddade substratytan och fungera som en byggnadsställning för att stelna lipidbilayerna. Denna interaktion gör dubbelskikten tillräckligt robusta för att möjliggöra upprepade och reproducerbara elektrontransportstudier på monoskiktsmode under omgivande förhållanden och vid rumstemperatur.

Fig. 2.

AFM-bilder av bR-innehållande smälta membran. (A vänster) representativa AFM-bilder (2 2 2 2 oc) av monolager av sammansmälta membran av BR-innehållande vesiklar, framställda genom 10-min adsorption på Al/AlOx-substrat, derivatiserade med Aptm. (A höger och B höger) Linjeskanningar som visar en genomsnittlig höjd av de starkaste funktionerna i 5,2 nm i 2. Höjdstången täcker 20 nm. (B till vänster) en tätare packad bR innehållande ett monoskikt, framställt genom 20-min adsorption av vesiklar på substratet (1,25 – 1,25-1,25-bild). Sprickan i membranet, inducerad av överdriven torkning (något som försiktigt undviks vid beredningen av proverna som används för elektriska transportmätningar) visar att monoskiktet är 5, 1 nm tjockt (mellan markörer).

I–v-mätningar utfördes på plana korsningsstrukturer i ett klass-10000 renrum vid 293k och 40% relativ fuktighet, med provet inklämt mellan Al/AlOx-substratet och Au-kontakterna. På varje prov avsattes flera små Au-dynor med 0,5 mm diameter på monoskiktet med LOFO-tekniken. Kretsen avslutas genom att försiktigt placera en volframelektrod på guldelektroden (11). Den främsta fördelen med att använda LOFO-tekniken för att förbereda toppkontakt, jämfört med metallförångningsavsättning eller kvicksilverkontakter, är att de förformade metallplåsterna kan flyta på och spänna över några små hål och sprickor (vanligtvis i tiotals nanometer), vilket gör elektriska mätningar framgångsrika. Fig. 3 A visar typiska I-V-egenskaper hos en resulterande metall / (bR monolayer-in-lipid-dubbelskikt) / metallkorsning över ett 1-V-förspänningsområde i 1-V. I-V-kurvorna registrerades efter mörk jämvikt följt av bestrålning med grönt ljus (Aci > 550 nm, 20 mW/cm2). I mörkret detekterades 0,75 nA-flöden vid en 1-V applicerad förspänning. Efter steady-state belysning med grönt ljus ökar strömmen från 0,75 till 1,7 nA vid en 1-V applicerad förspänning. När det gröna ljuset var blockerat, förfaller strömmen över 2-3 min till sitt ursprungliga mörka värde. Möjligen är ljuseffekten associerad med bildandet av den fotokemiskt inducerade m-mellanprodukten som mycket väl kan ha ett långsammare termiskt förfall under torra monolagerbetingelser än i membran i lösning (18). Systemet kan cyklas mellan dessa två tillstånd genom att växla grönt ljus och mörk anpassning, vilket indikerar att bR-beredningen behåller sin fotoaktivitet. Styranordningar med endast ett APTMS-monolager införlivat mellan Al / AlOx-och Au-kontakter kortslutes alltid med typiska korsningsmotstånd <50 kg, vilket indikerar att AlO x-skikten är tunna nog för tillförlitliga elektriska mätningar.

Fig. 3.

I–V-egenskaper hos metall–(bR-monolager) – metallkorsningar. (A) I–V-kurvor för en au/(wild–type bR)/(APTMS–AlOx-Al) – korsning innehållande orienterat bR-monolager, framställt genom vesikelfusion och uppmätt vid omgivande förhållanden i mörkret, vid belysning vid Bisexuell > 550 nm och mörk anpassning. Pilarna visar att I–V-svaren kan cyklas mellan de två tillstånden. Au pad-området var 2,10 – 3 cm2. (B) Plot av mörka strömmar vid a +1,0-V förspänningsspänning för åtta oberoende korsningar framställda från bR/PC-vesiklar respektive från bR/OTG-vesiklar.

den avgörande roll som bR spelar för att producera de uppmätta transmembranströmmarna illustreras med användning av ett annat monoskiktsmembran med högre bR-innehåll, som bereddes som rapporterats i ref. 14 genom att använda OTG som tvättmedel för bR vesikelbildning. Dessa två typer av bR-monoskikt (innehållande membran med olika bR-innehåll framställt från bR/PC eller bR/OTG-vesiklar) kommer att noteras som membran A eller B och korsning a eller B för motsvarande korsningar. De typiska absorbanserna (i OD) vid 560 nm är 0,15 10-3 och 1,0 10-3 för membran a respektive B. BR-halten i membran B (6 gånger högre än i membran A) är liknande bR-halten i ett torrt PM-monolager, baserat på både den experimentella absorbansen (18) och värdet, beräknat för ett idealiskt PM-monolager (1 10-3 160 nm vid 560 nm). Genomsnittliga mörka strömmar vid en given applicerad förspänning av korsningar B är nästan åtta gånger de som finns med korsningar A, dvs mycket nära proportionella mot bR-innehållet i membranen (Fig. 3 B). Detta resultat tyder på att elektroner passerar huvudsakligen via bR genom membranet snarare än genom lipidbilayerna. Båda korsningarna A och B är fotoaktiva och, när de normaliseras till bR–innehåll, visar liknande I-V-egenskaper.

de genomsnittliga ljuseffekterna på det aktuella flödet av korsningar A och B är vanligtvis 1 och 3 Na vid en 1-V applicerad förspänning. Den ljusinducerade förändringen i korsning B-ström är något lägre än väntat, baserat på bR-innehållet i de två typerna av prover. Skillnaden kan bero på skillnader i fraktionerna av m-mellanprodukten som kan ackumuleras i proverna A och B och/eller med skillnader mellan de två proverna i den fotoinducerade proteinkonformationsförändringen, införd av M-bildning.

mätbart strömflöde genom det 5 nm tjocka proteinet är anmärkningsvärt, jämfört med andra liknande system med samma gap. Till exempel noterar vi att en typisk 1-nm-lång peptid kommer att passera 12 na vid 0,5 v (19), liknande den som passeras av en enda 1,2-nm-lång oktanditiol (20). Alla andra faktorer som är lika och antar en exponentiell minskning av (tunnel) ström med ökande molekylängd, ger en ström av 10-23 a för ett 35-nm2-område (motsvarande området för en bR-trimer plus lipider), med hjälp av Simmons-modellen för direkt tunnling (jämför avsnitt 2 och figur 2 i ref. 21). Baserat på våra optiska absorptionsdata uppskattar vi densiteten hos bR i våra membran att vara 109 bR trimer per 0.002-cm2 korsning. Detta värde översätts till en experimentellt uppmätt ström av 3 10-19 a per br trimer, d. v. s., minst fyra storleksordningar mer än vad som beräknas för direkt tunnling genom 5 nm peptider, alkyler eller ett dielektriskt medium med liknande dielektrisk konstant. Det är därför troligt att processen med nuvarande transport är mer komplex än enkel tunnling genom en enda barriär. Faktum är att naturliga proteiner vars funktion involverar elektronöverföring ofta behöver överföra elektroner med hög riktningsspecificitet över stora avstånd. Sådan överföring över längre avstånd innefattar alltid en kedja av kofaktorer, såsom redoxcentra (22). I analogi med dessa redoxcentra kan vi betrakta retinal, det Kubi-elektronsystem som ligger i mitten av bR, som en mellanprodukt på elektronernas väg genom proteinet. Om, i stället för att tunnla genom en lång molekyl, sker processen i (åtminstone) två steg, med en delokaliserad elektronväg-station 2,3 nm från varje sida, uppskattningar som liknar de som används ovan ger strömmar av 10-20 a per 35 nm2 (21) .

för att kontrollera denna sista ide experimentellt förberedde och undersökte vi korsningar av retinalfria bR-membran. För att förbereda dessa membran upplyste vi först proteinet blandat med hydroxylamin. Denna reaktion leder till att den protonerade Schiff-basbindningen bryts, vilket ger apo-proteinbakterioopsin (BO) och retinaloxim, som förblir fäst vid membranet (12). Retinaloximen avlägsnades sedan genom att omsuspendera apo-membranen i en lösning av BSA, följt av inkubation och centrifugering. BSA solubiliserar konkurrenskraftigt retinaloximen som är inbäddad i membranet. Upprepad centrifug tvättar bort BSA när proteinet har renats av alla kromofor föroreningar (5). Strömflödet genom det (retinalfria) apo-membranet är ungefär tre storleksordningar lägre än vad som observerades med infödda bR-membran (jämför fikon. 4 A och 3 A). Strömmen var mycket högljudd och instabil. Detta resultat stöder tanken att strömmen flyter dominerande genom bR-proteinerna och att näthinnan fungerar som en aktuell transportmediator. Dessutom kan fotoeffekten som observerats med de infödda bR-innehållande membranen tillskrivas näthinnan.

Fig. 4.

I–V-egenskaper hos metall-apo–membran-metallkorsningar. (A) typisk I–V-egenskap hos en Au/apo-membran(retinalfri)/(Aptm–AlOx–Al) korsning framställd genom vesikelfusion och uppmätt vid omgivande förhållanden. (B) I–V-kurvor för au/apo-membran(apo–protein bR plus retinaloxim)/(APTMS–AlOx-Al) korsning framställd genom vesikelfusion och uppmätt vid omgivande förhållanden i mörkret och vid belysning vid Bisexuell > 550 nm. Ingen fotoeffekt på korsningsströmmen observerades.

för att kontrollera om retinal–proteinkovalent bindning är en förutsättning för elektrontransport mätte vi apo-membranprover innehållande retinaloxim. Åtminstone en del av retinaloximen kommer fortfarande att uppta retinalbindningsstället som härleds från CD-spektroskopi (23). I-V-kurvor för sådana prover visade beteende som liknar det hos native bR i termer av nuvarande storlek, men de visade inte något svar på grönt ljus som förväntat i prover som saknade absorption i denna region (Fig. 4 B). I-V-egenskaperna är närmare linjära än vad vi finner för vildtypsprover, vilket kan indikera en förändring av tunnelgapet mellan retinal och retinaloxim.

för att kasta ytterligare ljus på effekten av retinal isomerisering och fotocykeln på ljuseffekten studerade vi konstgjorda pigment härledda från 13-cis (3)-låsta retinaler (schema 1), där den kritiska C 13 inbäddad bild1C 14 isomerisering blockeras av en 5-ledad ringstruktur (24, 25). I-V-egenskaper som liknar de som erhållits med apo-membran med retinaloxim finns för de konstgjorda pigmenten. Bristen på fotoeffekt i korsningar gjorda med apo-membran överensstämmer med frånvaron av en fotocykel i dessa prover (24, 26), vilket stöder hypotesen att förekomsten av retinal isomerisering är en förutsättning för ljuseffekten. Vi antar att ingen uttalad, elektrisk fältinducerad, bR-konformationsförändring inträffar (dvs. bR kommer att förbli native-liknande) i fälten i 10 6 v/cm i hela proteinet som nås i våra experiment. Vi noterar att Au – toppelektroden är halvtransparent för grönt ljus. Till exempel sänder en 55-nm Au-film 70% vid 550 nm (27). Ett möjligt fysiskt ursprung av fotoeffekten från nanogap, plan, metall nanostruktur själv, till exempel genom ytplasmon excitation, kan säkert uteslutas (28). På grundval av dessa och de ovan beskrivna resultaten tillskriver vi fotoeffekten på korsningsströmmarna till 13-cis/all-trans retinal photoisomerization (4) och proteinkonformationsförändringarna som härrör från den. Vi noterar att elektronerna i våra experiment härstammar från metallelektroder och passerar genom bR från elektrod till elektrod under applicerad spänning, med bR som ett elektroniskt ledningsmedium. I detta avseende skiljer sig bR från system som de fotosyntetiska reaktionscentren, där elektronöverföring mellan kofaktorer fotoinduceras.

det framgår av beräkningarna och från exempelvis det negativa resultatet av Fig. 4 A att mekanismen inte (endast) är en direkt tunnling. Det är också osannolikt att vara (enbart) en av hopping med tanke på (enda molekyl) resultaten av arbetet i Selzer et al. (29). Hur kan då elektronerna korsa proteinet? Våra experimentella resultat indikerar tydligt att retinalkromoforen är en nödvändig komponent för ledningsprocessen. Det är välkänt att näthinnan är ansluten till den extracellulära sidan via ett H-bundet nätverk, vilket förmodligen ger en elektrostatiskt skärmad väg för laddningstransport. Eftersom det också finns god koppling mellan näthinnan och den extracellulära sidan i mörkret, måste denna väg vara närvarande oavsett belysning. Dess närvaro kan förklara de högre än förväntade strömmar som vi mäter. Anslutningen av näthinnan till den cytoplasmiska ytan är känd för att vara ljusaktiverad, vilket kan förklara den ljuseffekt som vi observerar. Båda dessa förslag behöver ytterligare utredning.

vikten av laddningsöverföring mellan retinalkromoforen och proteinmiljön för bR i dess marktillstånd föreslogs, baserat på teori, av Sakai et al. (30). Dessa författare antog att kromoforen stabiliseras i bR genom en interaktion mellan dess högsta ockuperade och lägsta obebodda molekylära orbitaler med proteinmiljön. Om tillräcklig laddning överförs mellan två platser, på grund av den starka högsta ockuperade–lägsta obebodda molekylära orbitalinteraktionen, kan den (kubikonjugerade) kromoforen ses som en enelektronreducerad/oxiderad Art (om den beter sig som en elektronacceptor/givare). Den mest sannolika kromofor-proteininteraktionen beräknades vara via det H-bundna nätverket längs den förmodade protonvägen.

det är också frestande att föreslå att protonkopplad elektrontransport (22, 31) spelar en roll eftersom det finns kvasi-endimensionella protonerade vattenkedjor i protonkanalen hos bR (32, 33) inbäddade i fasta stödda lipidbilayers, vilket kommer att vara normalt för de två elektroderna i vår inställning (17). Detta förslag kan förklara en del av skillnaden mellan elektrontransport genom bR och genom förment vattenfria peptider. Med tanke på en sådan situation uppstår flera frågor.

  1. hur mycket, om alls, kan elektrontransport genom bR dra nytta av en inbyggd protonkanal?

  2. hur kommer kromoforen och den mellanliggande proteinstrukturen att påverka hastigheten för långdistanselektrontransport?

  3. i vilken utsträckning kan bundna vattenmolekyler inuti bR bidra till den elektroniska strömmen?

eventuellt kan temperaturberoende I-v–mätningar, även om dessa är långt ifrån triviala med detta system, belysa dessa frågor.

vi noterar att, till skillnad från fallet för ett bR-monoskikt i lösning, är den Faradaiska fotokurren för ett torrt bR-monoskikt som härrör från transmembranprotontranslokation försumbar jämfört med de observerade korsningsströmmarna eftersom protonkällan är begränsad. Vårt konstaterande att alla observerade korsningsströmmar (i mörkt eller under grönt ljus) är noll, inom experimentellt fel , stöder frånvaron av steady-state protontranslokation. Det finns därför ingen mätbar photoresponse mellan ca 30 MV och 0 V (jfr. ref. 34; alla 15-till 20-MV-fotovoltage är i bullret från vår mätning), vilket indikerar att ljusdriven protontranslokation över bR-monoskiktet som hålls mellan elektroderna bidrar försumbart till steady-state-ljusströmmarna. Denna slutsats bekräftades av de proton-translokationsinducerade bR-fotokurrenterna i liknande faststödda lipidbilayers (typiskt 4-8 nA/cm2) (18) som är två till tre storleksordningar lägre än korsningsströmmarna som vi mäter här (0,5–5 xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx). Ändå, även utan någon direkt koppling mellan proton-och elektrontransport, noterar vi att ett protein som från elektrostatikens punkt (screening) är lämpligt för protonöverföring, kan mycket väl kunna använda samma mekanism för screening för att underlätta elektrontransport.

Vi kan också jämföra våra resultat med de tidigare rapporterade fotokurrenterna genom 500-nm (8) och 100-nm (9) torra multilayers genom att beräkna värden per PM monolager (5 nm). En sådan normalisering ger värden på 0,01 na per enstaka PM-skikt per cm2, d. v. s., cirka fyra till fem storleksordningar mindre än de korsningsströmmar som vi mäter här (0,5–5 xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx). Denna dramatiska skillnad illustrerar svårigheten att tolka de tidigare banbrytande mätningarna (9) och betonar vikten av att använda en så väldefinierad konfiguration som möjligt för elektrontransportmätningar av biologiska system. Med sådana konfigurationer blir det då också möjligt att göra mätningar som en funktion av kontrollerade variationer av systemet.

resultat och diskussion en suspension av PM-fragment innehållande vildtyp bR bereddes (12) och rekonstituerades med exogen äggfosfatidylkolin (PC) i vesiklar genom en modifiering av Racker-metoden (13). För att ytterligare kontrollera proteinmängdsberoende strömspänningsegenskaper (i-V) framställdes en annan vesikulär bR-suspension med användning av oktyltioglukosid (OTG) som tvättmedel (14). Monolager av de infödda bR-innehållande membranen framställdes sedan genom…

resultat och diskussion en suspension av PM-fragment innehållande vildtyp bR bereddes (12) och rekonstituerades med exogen äggfosfatidylkolin (PC) i vesiklar genom en modifiering av Racker-metoden (13). För att ytterligare kontrollera proteinmängdsberoende strömspänningsegenskaper (i-V) framställdes en annan vesikulär bR-suspension med användning av oktyltioglukosid (OTG) som tvättmedel (14). Monolager av de infödda bR-innehållande membranen framställdes sedan genom…

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.